GeneChip™ WT PLUS Reagent Kit: Полное транскриптомное профилирование

Пожалуйста, обратитесь к Руководству по реагентам для микрочипов и наборов для экспрессии, чтобы подобрать правильные реагенты для вашей матрицы.

Для анализов IVT значение RIN должно быть 6 или выше. Для анализов WT нет рекомендаций, основанных на праймировании анализа.

Последовательности всех наших контролей можно скачать из файла последовательностей, который доступен на страницах продуктов на thermofisher.com.

Например, вот ссылка на страницу продукта для Clariom D Assay, human:
Перейдите в раздел "Software & Data Analysis" и в подразделе "Support Files" нажмите на "Sequence Files: Clariom D Array, human Probe Sequences, tabular format", который вы можете открыть в Excel.

Примечание: Если файл контрольных последовательностей недоступен, пожалуйста, свяжитесь с нами.

Базы данных псевдогенов не были включены в дизайн экспрессионных микрочипов.

Первое разведение контрольного образца Poly-A RNA можно хранить при -20 градусах C в течение 6 недель (до 4 циклов заморозки/разморозки).

Меченый материал можно хранить в течение 2 недель при -20 градусах C.

Протоколы для массивов Gene 1.0 ST и Exon 1.0 ST одинаковы до этапов фрагментации и мечения.
В зависимости от количества входного материала, пожалуйста, обратитесь к протоколу набора реагентов GeneChip WT Pico Reagent Kit или GeneChip WT PLUS Reagent Kit:
- WT Pico: 50 - 500 нг суммарной РНК
- WT PLUS: ≥ 100 пг суммарной РНК (приблизительно 10 клеток)
Начиная с этапа гибридизации, различия в протоколе обусловлены форматом массивов. Exon array — это массив формата 49, а Gene 1.0 ST array - массив формата 169.
Для этапа работы с жидкостями следует использовать следующие скрипты в зависимости от используемого массива:
- Gene 1.0 St array: FS450_0001
- Exon 1.0 St array: FS450_0007

Типичный срок годности для микрочипов анализа экспрессии генов следующий:
- Все коммерческие картриджи для анализа экспрессии генов ≥ 8 мкм стабильны до 24 месяцев.
- Все коммерческие картриджи для ресеквенирования ≥ 8 мкм стабильны до 18 месяцев.
- Все коммерческие планшеты для анализа экспрессии генов ≥ 8 мкм стабильны до 18 месяцев.

Пожалуйста, обратите внимание, что это не относится к таким продуктам, как Exon или Gene array, поскольку они представляют собой картриджи и планшеты размером 5 мкм.

Control Oligo B2 (3 nM) — это предварительно меченый ДНК-контроль, необходимый для гибридизации с контрольными зондами на массиве. Это нужно для выравнивания сетки с помощью AGCC. Если Control Oligo B2 не будет включен в гибридизационный коктейль, программное обеспечение не сможет наложить сетку на отсканированное изображение, что приведет к невосполнимой потере данных образца с массива. Отсутствие Control Oligo B2 также лишает клиента возможности подать запрос на замену массива.

Рекомендуемое исходное количество общей РНК на образец составляет 100 нг при соблюдении стандартного протокола. В качестве минимального значения можно использовать 50 нг.

Для подготовки образцов к использованию с Gene 1.0 ST Array и Gene 2.0 ST Array рекомендуется использовать набор WT Plus или набор WT Pico.

Путем титрования геномной ДНК обратно в образцы тотальной РНК и мониторинга ухудшения данных массива было определено во время разработки анализа, что умеренное количество загрязнения геномной ДНК будет оказывать лишь минимальное влияние на результаты массива. Таким образом, стандартные методы выделения РНК в сочетании с обработкой ДНКазой должны давать достаточно высококачественный образец для анализа на экзонных массивах.

Все продукты senseRNA, cRNA и cDNA, полученные с использованием GeneChip WT PLUS Reagent Kit и GeneChip 3' IVT PLUS Reagent Kit, могут храниться при -20 градусах C.

Использование анализа WT для частично деградировавших образцов может быть привлекательной стратегией для профилирования этих образцов. Однако, на данный момент это не было протестировано в процессе разработки; поэтому рекомендуется использовать только высококачественные образцы тотальной РНК.

Анализ WT Plus оптимизирован для создания мишеней, предназначенных специально для гибридизации с конструкцией типа Whole Transcriptome (WT). Мишень находится в прямой ориентации, а GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array разработан для совместимости с антисмысловыми мишенями. Поэтому не рекомендуется смешивать анализы и типы массивов.

Мы гарантируем до трех циклов заморозки/разморозки для набора реагентов GeneChip WT Plus.

Мы рекомендуем следующие анализы в зависимости от размера вашего образца:
- WT Plus Assay для 50-500 нг общей РНК, выделенной из цельной крови, культивированных клеток и свежих/свежезамороженных тканей.
- WT Pico Assay для 100 пг - 50 нг общей РНК, выделенной из цельной крови, культивированных клеток и свежих/свежезамороженных или FFPE тканей.

В анализе есть несколько безопасных точек остановки, в том числе:

-После реакции IVT и этапа очистки кРНК в первом цикле, перед переходом ко второму циклу обратной транскрипции
-После обратной транскрипции и этапа очистки одноцепочечной кДНК во втором цикле, перед фрагментацией и мечением
-После фрагментации и мечения, перед гибридизацией

На биоанализаторе фрагментированная одноцепочечная ДНК-мишень должна иметь пик, центрированный в районе 40-70 оснований, при этом большинство фрагментов находятся в диапазоне от 20 до 200 оснований.

Чрезвычайно высокий выход кРНК при использовании набора реагентов GeneChip WT PLUS может быть вызван загрязнением геномной ДНК (гДНК). В зависимости от уровня загрязнения гДНК могут наблюдаться низкие сигналы массива и низкое значение AUC положительных по сравнению с отрицательными контролями.

В зависимости от типа образца, количества входной РНК и необходимого оборудования, существует несколько вариантов картриджей и планшетов для массивов.
- Картридж с GeneChip Pico Kit для 100 пг–50 нг суммарной РНК из цельной крови, культивируемых клеток и свежих/свежезамороженных или FFPE тканей.
- Картридж с GeneChip WT Plus Reagent Kit для 50–500 нг суммарной РНК, выделенной из цельной крови, культивируемых клеток и свежих/свежезамороженных тканей.
- 24- или 96-луночный планшет с GeneChip Pico Kit для 100 пг–50 нг суммарной РНК из цельной крови, культивируемых клеток и свежих/свежезамороженных или FFPE тканей, для анализа на приборе GeneTitan MC.
- 24- или 96-луночный планшет с GeneChip WT Plus Reagent Kit для 50–500 нг суммарной РНК, выделенной из цельной крови, культивируемых клеток и свежих/свежезамороженных тканей, для анализа на приборе GeneTitan MC.
Дополнительную информацию о предлагаемых вариантах Clariom S можно найти в документе Data Sheets: Clariom S Solutions document на веб-сайте Thermo Fisher.

Используя кРНК, полученную в результате реакции IVT в конце первого цикла анализа в качестве матрицы, одноцепочечная ДНК синтезируется с использованием случайных праймеров и смеси dUTP + dNTP. Полученная одноцепочечная ДНК (ss-ДНК), содержащая неестественное основание урацил, затем обрабатывается урацил-ДНК-гликозилазой, которая специфически удаляет остаток урацила из молекул ss-ДНК. В той же реакции фермент APE 1 затем расщепляет фосфодиэфирную основу в месте отсутствия основания, оставляя 3'-гидроксильный и 5'-дезоксирибозофосфатный терминал.

Да, для микрочипов GeneChip можно использовать как поли(A)+ мРНК, так и тотальную РНК в качестве входного материала. Протоколы, представленные в руководстве, описывают процедуры подготовки биотинилированной целевой РНК как из очищенной эукариотической поли(A)+ мРНК, так и из образцов тотальной РНК. Высококачественная мРНК была успешно выделена из клеток и тканей млекопитающих с использованием специальных наборов, и эта мРНК может быть использована в качестве матрицы для синтеза кДНК. Однако важно отметить, что результаты, полученные из образцов, подготовленных с использованием разных методов (тотальная РНК против поли(A)+ мРНК), могут быть неидентичными, поэтому рекомендуется сравнивать только образцы, подготовленные с использованием одного и того же протокола подготовки образцов.

Да, высокое содержание рибосомной РНК (рРНК) может влиять на процесс амплификации. Рибосомные РНК — это самые распространенные типы РНК, присутствующие в клетках, и они могут конкурировать с матричными РНК (мРНК), которые обычно являются мишенями, связывающимися с зондами на массиве, во время обратной транскрипции и амплификации. Эта конкуренция может привести к менее эффективной амплификации мРНК, что может повлиять на общее качество и надежность полученных данных.
Однако важно отметить, что это не обязательно вызывает "случайную" амплификацию праймеров.
Праймеры, используемые на этих этапах, разработаны для специфичного связывания с мРНК, в зависимости от используемого анализа, а также от зондов на массиве, поэтому присутствие избыточного количества рРНК не должно приводить к их связыванию и амплификации случайных последовательностей. Но это может снизить эффективность амплификации специфических последовательностей, для которых предназначены зонды.
В качестве наилучшей практики, в зависимости от природы входного материала, мы часто рекомендуем удалять рРНК из образцов перед выполнением этих этапов, особенно при работе с образцами тотальной РНК. Существует несколько коммерчески доступных наборов и методов для удаления рРНК.

Мы не избегаем глобина с помощью дизайна праймеров для микрочипов GeneChip. Все наши анализы метят и/или амплифицируют глобин РНК, и амплифицированные глобины гибридизируются и генерируют сигналы массива.
Однако наши WT (полнотранскриптомные) анализы генерируют ДНК в качестве мишеней для гибридизации, что позволяет генерировать сильные сигналы целевых транскриптов даже в присутствии глобинов. Это контрастирует с анализами IVT (in vitro транскрипция), где связывание сгенерированных меченых РНК-мишеней и сигналы массива слабее из-за интерференции глобина. Поэтому необходимо проводить удаление глобина при использовании анализов IVT.

Образцы тотальной РНК должны быть свободны от геномной ДНК, и мы рекомендуем включать обработку ДНКазой в метод очистки РНК. Загрязняющая геномная ДНК может быть амплифицирована вместе с РНК, что может привести к неточному измерению экспрессии всего транскриптома. Кроме того, загрязняющая геномная ДНК может привести к завышению количества РНК.​
Мы настоятельно не рекомендуем использовать методы на основе нуклеиновых кислот и те, которые содержат гликогеновые носители, во время очистки РНК, поскольку многие из них, как было показано, производят продукты кДНК в реакции синтеза первой цепи. Выберите метод очистки или имеющийся в продаже набор, подходящий для вашего количества образца. Для ограниченного количества клеток выбирайте методы очистки, которые позволяют очищать препараты тотальной РНК из небольших количеств.