GeneChip™ miRNA 4.0 Array, 2 массива для профилирования miRNA человека, мыши, крысы и других организмов

Информацию о видах можно найти в файле аннотации интересующего вас miRNA array.
Пожалуйста, выполните следующие действия:
- Перейдите на сайт www.thermofisher.com и откройте страницу интересующего вас array.
- Прокрутите страницу вниз до раздела support files.
- Загрузите файлы аннотации для интересующего вас miRNA array и откройте их в Excel.
- В файле будет столбец species scientific name. В этом столбце будут указаны все виды, представленные на array.

Контроли ERCC не размещены на GeneChip miRNA arrays, поскольку они не будут работать с системой miRNA array/assay. Наборы для мечения FlashTag Biotin HSR RNA Labeling Kits, используемые для мечения miRNAs, оптимизированы для коротких РНК. Хотя более длинные мРНК, такие как контроли ERCC, будут помечены, условия HWS (гибридизация/отмывка/окрашивание) не являются оптимальными, и, следовательно, более длинные мРНК обычно не обнаруживаются.

Поскольку некоторые miRNA консервативны для разных видов, на микрочипах miRNA может быть несколько копий одного и того же зонда. Однако, обработка образцов с помощью наборов для мечения РНК FlashTag Biotin HSR обеспечивает избыток мишени по сравнению с зондами на чипе. Следовательно, достаточно образца для гибридизации со всеми реплицированными зондами.

Зонды для snoRNA, scaRNA и шпилек выбираются таким образом, чтобы максимизировать реакцию зонда на концентрацию мишени в образце, минимизируя при этом перекрестную гибридизацию с другими потенциальными мишенями в образце. Чтобы минимизировать перекрестную гибридизацию, потенциальные мишени выводятся из массива известных последовательностей из входного набора данных и используются в процессе фильтрации, называемом прореживанием, который штрафует кандидатов в зонды, которые могут перекрестно гибридизоваться с нежелательными мишенями. По мере улучшения массива известных последовательностей мы можем улучшить наш набор для прореживания, чтобы избежать кандидатов в зонды, которые ранее считались уникальными. Улучшенный набор для прореживания снизит вероятность перекрестной гибридизации зонда с нежелательной мишенью, улучшив представление набора зондов для предполагаемой мишени. В результате улучшенного выбора зондов требуется меньше наборов зондов для представления того же количества последовательностей.

Нет, CEL-файлы, полученные с GeneChip miRNA Array, Thermo Fisher Scientific miRNA Array Strip и miRNA Array Plates, несовместимы.

Нет, GeneChip miRNA 4.0 Array не содержит микроРНК, специфичных для кошачьих.

Единственное различие – форм-фактор массива. Массивы имеют абсолютно идентичный дизайн и содержат одинаковое количество зондов и наборов зондов.

Сеть взаимодействий miRNA в программном обеспечении TAC доступна для всех генных массивов, включая модельные организмы. Для того чтобы сеть взаимодействий была доступна, одни и те же образцы должны быть обработаны как через генный массив, так и через массив miRNA. Кроме того, используемый генный массив должен иметь столбец с символами генов, отображаемый в его аннотации.

Зонды на микрочипе обнаруживают прямую (sense) последовательность-мишень.

Минимальное количество - 130 нг; максимальное количество - 1,000 нг суммарной РНК.

GeneChip miRNA Array 130 µL гибридизационного коктейля
Thermo Fisher Scientific miRNA Array Plates 120 µL гибридизационного коктейля
Thermo Fisher Scientific miRNA Array Strips 120 µL гибридизационного коктейля

Эти массивы имеют абсолютно идентичный дизайн и содержат одинаковое количество зондов и наборов зондов.

GeneChip miRNA Array 17 +/- 1 час
Thermo Fisher Scientific miRNA Array Plates 17 +/- 1 час
Thermo Fisher Scientific miRNA Array Strips 20 +/- 1 час

Для нормализации следует использовать не менее 5 miRs или SnoRNAs:

RU44, RU48 и/или U6 микроРНК, которые не изменяются между вашими образцами и как минимум в 5 раз превышают фоновый уровень, согласно вашим микрочипам. Эти miRs могут включать miR 15,16, 17 или let 7a, let 7b, let7c

Все 5 (или более) этих РНК не должны демонстрировать никаких изменений между образцами. Усредните некоторые или все из них, чтобы получить коэффициент нормализации, и примените к своим данным qRT-PCR.

qPCR пока не является золотым стандартом для валидации miRNA. В отличие от валидации мРНК, где ампликон уже присутствует в образце, для miRNA qPCR требуется, чтобы ампликон был синтезирован путем объединения образца либо со специально разработанной молекулой шпильки, добавления 3' полиА хвоста или другой манипуляции с образцом микроРНК. Процесс построения ампликона будет отличаться от образца к образцу и приведет к вариабельности результатов ПЦР. Однако по-прежнему очень важно подтвердить результаты микрочипов другим методом, таким как ПЦР. Тенденции повышения и понижения регуляции должны совпадать по направлению, даже если они не совпадают по величине.

F Sato. Intra-Platform Repeatability and Inter-Platform Comparibility of microRNA microarray technology. PLoS ONE May 2009, volume 4, issue 5, e5540.
D Sarkar. Quality Assessment and data analysis for microRNA expression arrays. Nucleic Acids Research 2009, vol. 37, no. 2, e17 (doi: 10.1093/ner/gkn932).

Большинство исследователей исключают нерелевантные виды из анализа, потому что дополнительные данные могут быть обременительными. Однако, рассмотрение проб, относящихся к нескольким видам, может повысить уверенность в данных. Мы обычно наблюдаем кластеризацию межвидовых miR, которые идентичны или почти идентичны.

У нас нет конкретных рекомендаций. Высококачественный образец РНК будет иметь соотношение не менее 1,95. Однако, если микроРНК присутствуют в образцах с более низкими значениями 260:280, эти образцы все равно можно использовать.

Обработка ДНКазой является необязательной. Она не требуется для образцов РНК, содержащих следовые количества геномной ДНК, но может быть полезна для образцов РНК, сильно загрязненных геномной ДНК, чтобы более точно количественно определить РНК. После обработки РНК ДНКазой крайне важно полностью инактивировать ДНКазу, прежде чем приступать к процедуре FlashTag, чтобы предотвратить деградацию реагента FlashTag (флакон 5). Для инактивации ДНКазы можно использовать различные колонки/наборы для очистки РНК. Инактивация ДНКазы высокой температурой может не полностью инактивировать фермент.

Для точного определения концентрации образца РНК мы рекомендуем использовать набор Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit (кат. № R11490) или спектрофотометр NanoDrop ND-1000.

Как тотальная РНК, так и низкомолекулярная РНК (LMW) могут быть помечены с помощью FlashTag Biotin HSR. Использование тотальной РНК может сэкономить время и деньги, а также предотвратить потерю образца.

Любой набор для очистки тотальной РНК или LMW (РНК с низкой молекулярной массой) будет совместим с FlashTag Biotin HSR. Элюируйте или ресуспендируйте РНК в воде, не содержащей нуклеаз. Убедитесь, что метод очистки сохраняет низкомолекулярные виды. Некоторые коммерческие продукты, которые были успешно протестированы с FlashTag Biotin HSR, включают:

mirVana miRNA Isolation Kit
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE
PureLink miRNA Isolation Kit
TRIzol reagent (только тотальная РНК) с дополнительной стадией осаждения в изопропаноле при -20 градусах C в течение ночи.