Набор для синтеза первой цепи кДНК Maxima H Minus (100 реакций)

Следовые количества реагентов, используемых в протоколах очистки РНК, могут оставаться в растворе и ингибировать синтез первой цепи, например, SDS, EDTA, соли гуанидина, фосфат, пирофосфат, полиамины, спермидин. Для удаления следовых загрязнений мы рекомендуем повторно осадить РНК этанолом и промыть осадок 75% этанолом, или повторно очистить РНК.

В целом, полезно минимизировать активность РНКазы H, когда вы стремитесь получить длинные транскрипты для клонирования кДНК. РНКаза H деградирует РНК из РНК-ДНК дуплексов, что может привести к укороченной кДНК во время обратной транскрипции длинной мРНК. Также рекомендуется использовать RTs без активности РНКазы H для независимого от матрицы добавления C нуклеотидов. В отличие от этого, обратные транскриптазы с собственной активностью РНКазы H часто предпочтительны в приложениях qPCR.

Чистота и целостность РНК необходимы для синтеза и количественного определения кДНК. Всегда оценивайте целостность РНК перед синтезом кДНК. Используйте свежеприготовленную РНК. Многократные циклы замораживания/оттаивания образца РНК и синтезированной кДНК не рекомендуются. Избегайте загрязнения РНКазой и утилизируйте РНК низкого качества.

Все обратные транскриптазы Thermo Scientific обладают собственной TdT-активностью, хотя и в разной степени в зависимости от условий реакции. Для добавления C-нуклеотидов, не зависящих от матрицы (как для экспериментов SMART и RACE), эта специфическая TdT-активность может быть индуцирована Mn2+. Мы рекомендуем Maxima H- или RevertAid H- minus RT для этой цели.

Синтез кДНК при более высоких температурах обеспечивает успешную транскрипцию РНК с высоким уровнем вторичной структуры, уменьшая проблемы доступа праймера к матрице. Поэтому мы рекомендуем использовать ферменты ОТ с высокой термостабильностью, например, обратные транскриптазы Maxima и Maxima H Minus, которые обеспечивают более высокий выход полноразмерной кДНК, лучшую чувствительность и успешную транскрипцию GC-богатых матриц.

Как правило, выгодно минимизировать активность РНКазы H при стремлении получить длинные транскрипты для клонирования кДНК. РНКаза H разрушает РНК из РНК-ДНК дуплексов, что может привести к укороченной кДНК во время обратной транскрипции длинной мРНК. Также рекомендуется использовать обратные транскриптазы без РНКазы H для не зависимого от матрицы добавления нуклеотидов C. В отличие от этого, обратные транскриптазы с собственной активностью РНКазы H часто предпочитают в приложениях qPCR.

Точность обратных транскриптаз RevertAid и Maxima такая же, как и у дикого типа M-MuLV RT, и составляет примерно 1 ошибку на 15 000-27 000 синтезированных нуклеотидов.

Все обратные транскриптазы Thermo Scientific (RevertAid RT, RevertAid H Minus RT, Maxima RT и Maxima H Minus RT) обладают внутренней TdT активностью, хотя и в разной степени, в зависимости от условий реакции. Для добавления шаблон-независимых C-нуклеотидов (как в экспериментах SMART и RACE), эта специфическая TdT активность может быть индуцирована Mn2+. Для этой цели мы рекомендуем использовать Maxima H Minus RT или RevertAid H Minus RT.