GeneChip™ Rat Gene 1.0 ST Array (2 массива) для профилирования транскриптома крысы

TAC 4.0 включает в себя два алгоритма для идентификации событий альтернативного сплайсинга: алгоритм TAC 2.0 и новый EventPointer. Алгоритмическое определение альтернативного сплайсинга остается сложной задачей. TAC 4.0 поддерживает два различных подхода, имеющих разные сильные и слабые стороны. После тщательного тестирования, новая “Оценка события” TAC 4.0 использует как предыдущую оценку события TAC 2.0, так и p-значение EventPointer и сортирует наиболее вероятные события альтернативного сплайсинга вверху. Разумеется, оценка события TAC 2.0 и p-значения EventPointer остаются доступными по отдельности.

Базы данных псевдогенов не были включены в дизайн экспрессионных микрочипов.

LIMMA: LIMMA расшифровывается как Linear Models for MicroArray data (Линейные модели для данных микрочипов). Это пакет R/Bioconductor, который предоставляет интегрированное решение для анализа данных экспериментов по экспрессии генов. Он содержит расширенные функции для обработки сложных экспериментальных планов и для заимствования информации для решения проблемы малых размеров выборки. За последнее десятилетие LIMMA стал популярным выбором для открытия генов посредством анализа дифференциальной экспрессии данных микрочипов. Существует ˜8000 цитирований с использованием LIMMA и массивов Affymetrix. Интерфейс TAC 4.0 предоставляет основные функции анализа дифференциальной экспрессии, включая реальные ковариаты и случайные факторы. Кроме того, интерфейс упрощает создание матриц дизайна и контрастов, которые определяют экспериментальный дизайн и сравнения для анализа.

Корректировка пакетного эффекта: Пакетные эффекты — это систематические изменения в интенсивностях образцов микрочипов, которые отражают изменения в анализе, иногда встречающиеся в разных пакетах. Эти эффекты чаще встречаются в крупных исследованиях, в которых все образцы не могут быть обработаны одновременно. TAC 4.0 предоставляет интерфейс к алгоритму корректировки пакетного эффекта ComBat, который может удалять пакетные эффекты из сигналов.

EventPointer: EventPointer — это пакет Bioconductor, который идентифицирует события альтернативного сплайсинга в данных микрочипов. TAC 4.0 включает в себя интерфейс к этому пакету.

Разведочный групповой анализ: Разведочный групповой анализ (EGA) — это интерфейс к набору R-пакетов, которые предлагают возможность изучить взаимосвязи между несколькими образцами микрочипов. Хотя у ученого обычно есть предвзятое представление о классификации образцов в эксперименте, полученные данные часто показывают дополнительную подструктуру из-за неожиданных биологических различий или пакетных эффектов. Интерфейс EGA позволяет идентифицировать эту подструктуру. Биологические различия можно дополнительно изучить с помощью анализа дифференциальной экспрессии LIMMA. Пакетные эффекты можно удалить с помощью ComBat, чтобы предотвратить их затмевание интересующей биологии.

Файлы .TAC формата TAC 3.1 не могут быть открыты в программном обеспечении TAC 4.0. Исследования необходимо будет переобработать в TAC 4.0. Новый анализ можно запустить из файлов .CEL или .CHP.

Меченый материал можно хранить в течение 2 недель при -20 градусах C.

Протоколы для массивов Gene 1.0 ST и Exon 1.0 ST одинаковы до этапов фрагментации и мечения.
В зависимости от количества входного материала, пожалуйста, обратитесь к протоколу набора реагентов GeneChip WT Pico Reagent Kit или GeneChip WT PLUS Reagent Kit:
- WT Pico: 50 - 500 нг суммарной РНК
- WT PLUS: ≥ 100 пг суммарной РНК (приблизительно 10 клеток)
Начиная с этапа гибридизации, различия в протоколе обусловлены форматом массивов. Exon array — это массив формата 49, а Gene 1.0 ST array - массив формата 169.
Для этапа работы с жидкостями следует использовать следующие скрипты в зависимости от используемого массива:
- Gene 1.0 St array: FS450_0001
- Exon 1.0 St array: FS450_0007

Мы не рекомендуем это. В крупномасштабных экспериментах по экспрессии с использованием схожих типов образцов исследователи, вероятно, разработают свои собственные руководства по оценке качества отдельных массивов, основанные на метриках, предсказывающих высокое или низкое качество образцов. Однако эти руководства, скорее всего, будут зависеть от типа образца, и мы не можем рекомендовать такие руководства для всех возможных ситуаций. Обратите внимание, что тенденция к использованию алгоритмов оценки сигнала на основе моделей (для всех экспериментов с микрочипами, даже за пределами платформы Thermo Fisher) значительно затрудняет определение качества отдельного массива из-за необходимости одновременного анализа нескольких массивов для расчета оценок сигнала.

Если образец кажется “сомнительным”, лучше оставить его в эксперименте для анализа и просто пометить как вызывающий вопросы. Во время начального анализа относитесь ко всем образцам одинаково. После того, как будут определены гены-кандидаты, просмотрите, как сомнительный образец изменяет данные по сравнению с другими повторностями внутри образца. Всегда можно удалить образец позже в рабочих процессах анализа.

Pos_vs_Neg_AUC - хороший показатель для первичной оценки. Значение ниже 0.7 указывает на возможные проблемы с образцом. Однако значение выше 0.7 не гарантирует, что образец хорош.

Пользователям будет полезно использовать SST-RMA при сравнении данных с данными, обработанными только с использованием суммирования RMA. RMA — это предлагаемый конвейер анализа для использования при контроле качества образцов FFPE или деградированных образцов. Для последующего анализа образцов FFPE или деградированных образцов предлагается использовать конвейер анализа SST-RMA.

При фильтрации по пороговым значениям fold-change ожидайте большего количества дифференциально экспрессированных генов по сравнению с RMA. При сравнении количества дифференциально экспрессированных генов (определенных фильтрами fold-change) с другими методами, такими как RT-PCR и RNA-Seq, ожидайте, что это число будет больше соответствовать этим методам при использовании SST-RMA. Отсутствует влияние на чувствительность или специфичность данных. SST-RMA был разработан для решения проблемы сопоставимости с другими технологиями. Те же рекомендации по экспериментальному дизайну все еще применимы при проектировании исследования экспрессии с использованием микрочипов.

Исторически сложилось так, что микрочипы, как считалось, занижают значения fold-change по сравнению с другими методами, такими как RT-PCR. Для клиентов, которые фильтруют данные с использованием порогового значения fold-change, SST-RMA решает проблему “сжатия fold-change” путем применения GC-коррекции, а также путем преобразования сигнала данных микрочипов в сигнальное пространство, аналогичное сигнальному пространству других методов, на этапе предварительной обработки перед RMA. В RMA никаких изменений внесено не было. SST-RMA — это алгоритм по умолчанию для Human Transcriptome Arrays и Clariom D Human, Mouse и Rat assays.

Файлы библиотеки находятся на странице каждого типа массива. Кроме того, файлы библиотеки можно установить непосредственно через TAC 4.0, перейдя на вкладку «Preferences» и нажав кнопку «Download Library Files» в верхнем левом углу (требуется учетная запись NetAffx).

Из-за объема памяти, необходимого для работы TAC, мы НАСТОЯТЕЛЬНО рекомендуем НЕ устанавливать TAC 4.0 на производственные компьютеры AGCC, используемые для сканирования и управления жидкостными системами.

В программном обеспечении TAC 4.0 принимаются файлы как .CEL, так и .CHP. Исключением являются предыдущие файлы *.exon*. CHP и *.alt-splice*. CHP. Эти два типа файлов CHP больше не поддерживаются в TAC 4.0. Файлы .ARR рекомендуются, поскольку они содержат информацию об атрибутах образца. Файл .CHP создается TAC 4.0 в процессе нормализации и суммирования.

TAC 4.0 — это новое программное обеспечение, которое объединяет многие функции Expression Console 1.4 с возможностями биологического анализа TAC в единый рабочий процесс. Некоторые из новых функций включают в себя:

- Выполнение контроля качества и статистического анализа в одном программном обеспечении
- Возможность анализа 1000 образцов
- Интеграция пакета LIMMA (LInear Modeling for MicroArrays package) в TAC 4.0 для анализа сложных данных
- Выполнение корректировки пакетного эффекта (новое)
- Выполнение анализа повторных измерений (улучшено в TAC 4.0)
- Выполнение анализа случайных факторов (новое)
- Выполнение анализа реальных ковариат (новое)
- Возможность выполнения анализа Exploratory Grouping Analysis (EGA)
- Интеграция алгоритма Event Pointer для анализа альтернативного сплайсинга
- Улучшенная визуализация с помощью Splicing Viewer

Файлы CEL экспрессионных микрочипов обрабатываются и анализируются в программном обеспечении TAC 4.0. Это бесплатная загрузка с веб-сайта Thermo Fisher для обработки файлов CEL.

Вот минимальные требования:
Microsoft Windows 7 и 10 (64 bit) Professional
CPU: 2.83 GHz
Memory: 8 GB RAM
Hard drive: 150 GB свободного места на жестком диске
Web browser: Internet Explorer 11 или новее и Microsoft Edge

Вот рекомендуемое оборудование:
Microsoft Windows 7 и 10 (64 bit) Professional
CPU: Intel Pentium 4X 2.83 GHz processor (Quad Core)
Memory: 16 GB RAM
Hard drive: 150 GB свободного места на жестком диске
Web browser: Internet Explorer 11 или новее и Microsoft Edge

Вам следует переанализировать свои данные, если вы сравниваете их с данными RT-PCR или RNA-Seq, используя значения fold change для фильтрации.

Нет, методы в технических документах не являются ANOSVA, который был опубликован в упомянутой статье. Следует отметить, что ANOSVA был разработан для комбинации экзон/соединение массива. Некоторые предварительные работы по сравнению ANOSVA и PAC (одного из двух методов, описанных в технических документах) на панели тканей экзонного массива показывают, что MiDAS и надежные методы PAC, представленные в технических документах, являются лучшим решением.

Пользователи GCOS должны использовать DTT v1.1, используя опцию 'Flat File', для переноса файлов из базы данных GCOS в независимую папку для анализа с помощью программного обеспечения Expression Console.

Наиболее вероятное объяснение заключается в том, что для отображения информации о дизайне массива и результатов массива использовалась другая версия сборки генома. При запуске для анализа массива предоставляются две версии файлов библиотеки, соответствующие Human Genome Build 34 и 35. Будьте внимательны и используйте согласованный номер версии, чтобы сопоставить дизайн массива с фактическими данными массива для визуализации в IGB.

Взаимосвязи между SNPs и наборами зондов экзонов можно получить, используя информацию о позиции сборки генома, которая предоставляется как для массива картирования, так и для массива экзонов. Одним из полезных инструментов для этого является UCSC Table Browser.

Существующее программное обеспечение для анализа exon array позволяет объединять несколько наборов проб на уровне экзонов в более крупный 'мета-набор проб'. Затем для этих мета-наборов проб вычисляются оценки сигнала PLIER и значения обнаружения DABG. Определение и группировка экзонов в ген могут оказать существенное влияние на итоговое значение сигнала конкретного гена. Affymetrix рекомендует использовать файлы группировки 'core gene' или 'full gene' для получения сигнала на уровне генов, который должен наиболее точно отражать экспрессию конститутивных экзонов.

Для получения дополнительной информации см. технический документ 'Оценка сигнала генов из Exon Arrays' .

DABG означает 'обнаружение выше фона' и является метрикой обнаружения, генерируемой путем сравнения зондов Perfect Match с распределением фоновых зондов. Это сравнение дает p-значение, которое затем объединяется в p-значение на уровне набора зондов с использованием уравнения Фишера. PLIER расшифровывается как 'Ошибка логарифмической интенсивности зонда' и представляет собой оценщик сигнала на основе модели, который выигрывает от многомерного анализа.

Для получения дополнительной информации о DABG смотрите технический документ 'Коррекция фона Exon Array'; для получения дополнительной информации о PLIER обратитесь к технической заметке PLIER.

На продолжительность анализа влияют два основных фактора: 1) количество массивов, анализируемых одновременно, и 2) количество наборов проб, которые необходимо включить в анализ. Уменьшение любого из этих двух факторов увеличит скорость анализа.

Нормализация .cel файлов занимает 1-3 минуты, а генерация сводок на уровне наборов проб DABG и PLIER - около 40 минут на .cel файл. Дальнейший анализ будет зависеть от применяемых методов анализа данных.

GeneChip Command Console (AGCC) предоставляется для управления станцией подготовки жидкости, 7G сканером и генерации .dat и .cel файлов. Анализ файлов .cel на уровне зондов осуществляется с помощью Expression Console. Это программное обеспечение позволяет генерировать оценки сигнала и p-значения обнаружения на уровне наборов зондов для анализа на уровне экзонов или генов. Expression Console можно свободно загрузить с нашего веб-сайта.

Для дополнительного анализа более высокого уровня, такого как обнаружение альтернативного сплайсинга, несколько экспериментальных алгоритмов опубликованы в виде методов в соответствующих информационных документах. Пользователям потребуется реализовать эти методы в пакетах программного обеспечения для расширенного статистического анализа. Эти методы были разработаны на основе опыта работы с ограниченными наборами данных образцов, и может потребоваться дальнейшая тонкая настройка в зависимости от уникальных биологических систем пользователя. Ожидается, что в ближайшем будущем будут появляться новые методы для улучшения поддержки анализа Exon Array.

Нет. Как и в случае с зондами на других современных экспрессионных массивах, существуют зондо-специфические эффекты, которые приводят к тому, что каждый набор зондов по-разному реагирует на количество целевого вещества. Таким образом, сравнение отношений сигналов между различными наборами зондов для сравнения уровней их экспрессии является недействительным.

Стандартные контрольные наборы для оценки экспрессии Affymetrix (т.е., бактериальные спайки), включающие контрольные спайки для гибридизации и контрольные спайки поли-А РНК, присутствуют на Human Exon 1.0 ST Array и могут использоваться для качественной оценки, как и раньше. Новой особенностью, уникальной для Exon Array, является то, что программное обеспечение Expression Console поддерживает извлечение остатков из модели PLIER при выполнении анализа нескольких массивов. Такие остатки могут использоваться для выявления массивов-выбросов и некачественных зондов.

Кроме того, для большинства из 100 генов контроля нормализации, используемых в конструкции GeneChip Human Genome U133 Array, на Exon Array размещены наборы зондов, представляющие как интронные, так и экзонные участки. Метрики наборов зондов экзонов и интронов (т.е., % обнаружения p-value <= 0.05, среднее/медианное значение сигнала) могут использоваться в качестве дополнительного метода для выявления проблемных массивов-выбросов или проблем с анализом.

Для этих новых экспериментальных аналитических метрик в данный момент не существует простых стандартных числовых пороговых значений, которые мы могли бы рекомендовать в качестве порогов для определения хорошо или плохо работающих массивов. Однако было обнаружено, что они ценны при сравнении относительных значений в наборе экспериментов для выявления массивов-выбросов. Смотрите технический документ 'Оценка качества Exon Arrays' для получения дополнительной информации.

Размер файлов .dat составляет приблизительно 750 МБ, а размер бинарных файлов .cel - приблизительно 60 МБ.