Среда William's E Medium без глютамина для клеточных культур

Вообще говоря, среду можно использовать до трех недель после добавления сыворотки. Нет формальных исследований, подтверждающих это, но это эмпирическое правило, используемое нашими учеными.

Мы обычно отправляем питательные среды, требующие длительного хранения в холодильнике, при комнатной температуре. Мы провели исследования на репрезентативных составах питательных сред, чтобы показать, что питательные среды могут находиться при комнатной температуре до недели без каких-либо проблем.

Очень часто микоплазменное загрязнение невозможно удалить из культуры, поэтому её следует выбросить. Возможно, у вас есть уникальная культура, которую вы не хотите выбрасывать и хотели бы попытаться очистить. Сообщается, что ципрофлоксацин и Плазмоцин использовались для этой цели. Если вас интересует протокол или инструкции по применению, обратитесь к поставщику антибиотиков или в опубликованную литературу. Обратите внимание, что микоплазмы очень трудно удалить из культуры, и они легко распространяются, поэтому обработанные культуры должны быть помещены в карантин до тех пор, пока они не будут очищены от микоплазм, и ваша лаборатория должна быть тщательно очищена.

Попробуйте сменить среду или сыворотку. Сравните составы сред на предмет различий в глюкозе, аминокислотах и других компонентах. Сравните старую партию сыворотки с новой. Увеличьте начальный посевной материал клеток. Наконец, адаптируйте клетки последовательно к новой среде.

Это может произойти, если клетки подверглись чрезмерной обработке трипсином. Трипсинизируйте в течение более короткого времени или используйте меньше трипсина. Загрязнение микоплазмой также может вызвать эту проблему. Изолируйте свою культуру и проверьте ее на наличие микоплазменной инфекции. Наконец, проверьте наличие факторов прикрепления в среде.

Это, скорее всего, признак бактериального или грибкового загрязнения. Мы рекомендуем утилизировать среду и попытаться деконтаминировать культуру.

Осадок может быть вызван остаточным фосфатом, оставшимся после мытья моющими средствами, который может осаждать компоненты порошковой среды. Промойте стеклянную посуду несколько раз деионизированной, дистиллированной водой, затем стерилизуйте. Если среда заморожена, попробуйте нагреть ее до 37 градусов C и перемешать для растворения. Если осадок остается, утилизируйте среду.

Пожалуйста, ознакомьтесь с возможными причинами быстрого изменения pH и предлагаемыми решениями:

- Неправильное парциальное давление углекислого газа: Увеличьте или уменьшите процент углекислого газа в инкубаторе в зависимости от концентрации бикарбоната натрия в среде. Для концентраций бикарбоната натрия от 2,0 до 3,7 г/л используйте количество углекислого газа от 5 до 10% соответственно. Переключитесь на среду, не зависящую от углекислого газа.
- Слишком плотно закрытые крышки на флаконах для культивирования тканей: Ослабьте крышки на четверть оборота.
- Недостаточное бикарбонатное буферирование: Добавьте HEPES-буфер до конечной концентрации 10-25 мМ.
- Неправильные соли в среде: Используйте среду на основе солей Игла (Earle's salts) в CO²-среде и среду на основе солей Хенкса (Hanks' salts) в атмосферных условиях.
- Бактериальное, дрожжевое или грибковое загрязнение: Утилизируйте культуру и среду. Попытайтесь деконтаминировать культуру.

Ниже приведены некоторые распространенные причины и решения проблемы:

- Неподходящая среда для роста: Используйте предварительно подогретую среду для роста, рекомендованную поставщиком.
- Сыворотка в среде для роста низкого качества: Используйте сыворотку из другой партии.
- Клетки пассировались слишком много раз: Используйте здоровые клетки с небольшим количеством пассажей.
- Клеткам позволили вырасти до состояния конфлюэнтности: Пассируйте клетки млекопитающих, когда они находятся в логарифмической фазе, до достижения конфлюэнтности.
- Культура заражена микоплазмой: Утилизируйте клетки, среду и реагенты. Получите новые запасы клеток и используйте их со свежей средой и реагентами.

Пожалуйста, ознакомьтесь с возможными причинами и решениями, которые мы рекомендуем ниже:

- Клетки хранились неправильно: Получите новый сток и храните в жидком азоте. Держите клетки в жидком азоте до размораживания.
- Домашний замороженный сток не является жизнеспособным: Замораживайте клетки с плотностью, рекомендованной поставщиком. Используйте клетки с низким пассажем для создания собственных замороженных стоков. Точно следуйте процедурам замораживания клеток, как рекомендовано поставщиком. Получите новый сток.
- Клетки были разморожены неправильно: Точно следуйте процедурам размораживания клеток, как рекомендовано поставщиком. Убедитесь, что вы быстро размораживаете замороженные клетки, но медленно разбавляете их, используя предварительно подогретую среду для роста, перед посевом.
- Среда для размораживания неверна: Используйте среду, рекомендованную поставщиком. Убедитесь, что среда предварительно подогрета.
- Клетки слишком разбавлены: Высевайте размороженные клетки с самой высокой плотностью, рекомендованной поставщиком, для оптимизации восстановления.
- С клетками обращались небрежно: Процедуры замораживания и размораживания являются стрессовыми для большинства клеток. Не используйте вортекс, не ударяйте колбы, чтобы отделить клетки (за исключением культивирования клеток насекомых), и не центрифугируйте клетки на высоких скоростях.
- Глицерин, используемый в среде для замораживания, хранился на свету (если применимо): Если глицерин хранился на свету, он превращается в акролеин, который токсичен для клеток. Получите новый сток.

Существует ряд факторов, которые могут способствовать этому:

1. Неправильный уровень CO²-контролируйте уровень CO² вручную с помощью комплекта Fyrite, доступного у Bacharach (http://www.bacharach-inc.com/fyrite_analyzers.htm). Проверьте, совпадают ли ручные показания с показаниями, отображаемыми на инкубаторе. Если инкубатор имеет распечатку данных, проверьте распечатку на предмет колебаний уровня CO². Проверьте настройки, чтобы убедиться, что уровни CO² установлены на соответствующие уровни для вашей клеточной линии (обычно от 5 до 10%). Часто проверяйте соединения линий на предмет утечек. Избегайте частого открытия и закрытия дверей инкубатора.
2. Колебания температуры в инкубаторе-Контролируйте температуру инкубатора с помощью хорошего термометра внутри инкубатора.
3. Фунгизон или другие профилактические антибиотики/антимикотики присутствуют в токсичных концентрациях-используйте их в рекомендованных дозах.
4. Неправильная влажность-проверьте уровень воды в водяной бане. Влажность жизненно важна для надлежащего газообмена для многих типов клеток и сред (т.е. соответствующие уровни CO² в значительной степени не имеют значения для большинства культур, если уровень влажности недостаточно высок).
5. Неправильное осмотическое давление в среде-проверьте осмоляльность полной среды. Большинство клеток млекопитающих могут переносить осмоляльность от 260 до 350 мОсм/кг. Добавление реагентов, таких как HEPES и лекарств, может повлиять на осмоляльность.
6. Загрязнение микроорганизмами-бактериальные и грибковые загрязнения обычно легко видны; симптомы микоплазменного загрязнения более тонкие, и для обнаружения этого типа загрязнения необходим тщательный мониторинг морфологии культуры и регулярное тестирование.
7. Используется неподходящая среда-еще раз проверьте, подходит ли используемая среда для вашего типа клеток и применения в культуре. Например, убедитесь, что среда, используемая для бессывороточной культуры, действительно предназначена для бессывороточной культуры; убедитесь, что соответствующие селективные препараты используются в соответствующих концентрациях; проверьте сроки годности используемых реагентов; и храните среду при соответствующих температурах в темноте.

Если состав среды содержит:
- NaHCO³ (г/л) <1.5, требуется CO² в 4%
- NaHCO³ (г/л) 1.5-2.2, требуется CO² в 5%
- NaHCO³ (г/л) 2.2-3.4, требуется CO² в 7%
- NaHCO³ (г/л) >3.5, требуется CO² в 10%

Однако есть исключения. Gibco DMEM всегда производилась в соответствии с оригинальной опубликованной формулой Dulbecco, с 3.7 г/л бикарбоната натрия. Клиенты десятилетиями использовали эту среду в CO² инкубаторах в диапазоне от 5-10% CO², обычно без проблем с поддержанием физиологического pH; это также зависит от типа клеток. После начала роста клеток pH будет падать (из-за метаболического накопления молочной кислоты).

Концентрация сыворотки будет варьироваться в зависимости от клеточной линии и используемой базальной среды.

Да. Наши специалисты Gibco по разработке сред по индивидуальному заказу и сотрудники отдела исследований и разработок могут предоставить консультации по вопросам добавления или исключения компонентов сред. Для более комплексных услуг наша команда PD-Direct Bioprocess Services специализируется на разработке и оптимизации сред.

У нас есть специальная команда специалистов по индивидуальным средам Gibco, которые могут сотрудничать с вами на этапах кастомизации, производства и доставки. Пожалуйста, отправьте свой запрос по электронной почте на custommedia@lifetech.com.

Используя Gibco Media Configurator, вы можете просматривать конкретные параметры настройки вашего продукта для культивирования клеток онлайн в любое время. Кроме того, этот инструмент обеспечивает более быстрое получение цен на среды, созданные по индивидуальному заказу, обычно в течение 48 рабочих часов.

Нет, Gibco Media Configurator нельзя использовать для запроса цен на продукты для клеточных культур, отличные от Gibco. Однако у нас есть большой опыт в производстве сред по рецептурам, принадлежащим клиентам. Пожалуйста, посетите www.thermofisher.com/custommedia или свяжитесь с нами по адресу custommedia@lifetech.com для получения дополнительной информации.

Конфигуратор сред Gibco позволяет добавлять, удалять и регулировать концентрацию компонентов. Кроме того, вы можете выбрать из ряда вариантов упаковки, тестов контроля качества и производства cGMP или не-cGMP.

Почти все базовые питательные среды Gibco для клеточных культур можно настроить с помощью Gibco Media Configurator. Чтобы проверить конкретный продукт, используйте страницу Media Configurator, чтобы выполнить поиск по каталожному номеру Gibco или просмотреть наше предложение по описанию. Для настройки продуктов Gibco, не являющихся средами, таких как буферы и факторы роста, свяжитесь с нами по адресу custommedia@lifetech.com.

Нет, вам не нужно регулировать pH жидкой среды после получения. pH должен быть в правильном диапазоне для использования. После добавления добавок (если необходимо), вы можете проверить pH еще раз и отрегулировать, если это необходимо. Однако обычно он не меняется значительно. Регулировать pH необходимо для сред, которые вы готовите самостоятельно из порошка, за исключением сред AGT, где pH и осмоляльность регулируются автоматически.

Питательные среды для клеточных культур Gibco готовятся с использованием воды, соответствующей всем требованиям монографии USP для воды для инъекций.

Вы можете найти протокол на нашем веб-сайте. Введите в главном поле поиска “Приготовление среды из порошка и концентратов” и нажмите Enter или кнопку Поиск. Это должно перенаправить вас на страницу с подробным протоколом.

Асептическая техника, разработанная для создания барьера между микроорганизмами в окружающей среде и стерильной культурой клеток, опирается на набор процедур, чтобы снизить вероятность загрязнения из этих источников. Элементы асептической техники включают в себя асептическую рабочую зону, хорошую личную гигиену, стерильные (или стерильно отфильтрованные) реагенты и среды, а также асептическое обращение.

Большинство нормальных линий клеток млекопитающих хорошо растут при pH 7,4, и между различными штаммами клеток наблюдается очень небольшая изменчивость. Хотя большинство исследователей обычно используют 5-7% CO² в воздухе, концентрация 4-10% CO² является обычной для большинства экспериментов по культивированию клеток.

Пожалуйста, ознакомьтесь со сравнительной таблицей здесь (удалена ссылка).

Да. Храните сыворотки животных при температуре от -5 до -20 градусов C. Храните питательные среды при температуре от 2 до 8 градусов C; используйте в течение рекомендованного срока годности. Храните полную (обогащенную) среду при температуре от 2 до 8 градусов C, а для полной среды рекомендованный срок годности составляет от 2 до 4 недель. Кроме того, минимизируйте воздействие света на сыворотки и питательные среды.

Пожалуйста, используйте наш инструмент поиска составов сред (https://www.thermofisher.com/search/results?docTypes=MediaFormulation&persona=DocSupport&linkIn=true&query=).