TRIzol Reagent: Универсальный реагент для выделения РНК, ДНК и белков

Деградировавшая РНК может вызывать повышенное поглощение при 260 нм.

Да, вы можете использовать TRIzol Reagent или набор для очистки РНК и нативного белка mirVana PARIS.

Пожалуйста, посетите наш веб-сайт для просмотра графика, показывающего измерения чистоты и сравнение индекса целостности РНК (RIN) вышеупомянутых наборов.

Набор для очистки РНК TRIzol Plus сочетает в себе лизирующую способность реагента TRIzol с удобной технологией экстракции РНК с использованием спиновых колонок из диоксида кремния, входящих в состав набора PureLink RNA Mini Kit.

Скорее всего, это полисахариды или клеточные мембраны; ДНК должна находиться в межфазном слое. В образцах, содержащих кровь (например, печень), поверх осадка может быть виден красный вязкий слой. Скорее всего, это продукты крови, и их не следует переносить вместе с супернатантом.

- Это часто встречается с образцами кожи. Предполагается, что в этих образцах есть жир, и жировые мицеллы всплывают во время центрифугирования. В образцах кожи мицеллы захватывают пигмент меланин, и водная фаза становится окрашенной. Жировые мицеллы также могут захватывать пигмент из самого реагента TRIzol и вызывать розоватый цвет. Если предполагается, что образец содержит жир, гомогенат образца в реагенте TRIzol можно центрифугировать до добавления хлороформа. Жир будет выглядеть как прозрачный слой в верхней части супернатанта; его следует отделить пипеткой и выбросить.
- Если образец содержит много крови, водная фаза может казаться мутной и/или желтоватой (это может быть связано с железом в гемоглобине). Если используемая центрифуга не холодная, органическая фаза будет иметь более насыщенный бордовый цвет; часть этого цвета может попасть в водную фазу и придать ей оранжевый или желтый цвет.
- Розоватая водная фаза также может быть вызвана чрезмерным разбавлением образца (т.е. соотношение образца к реагенту TRIzol > 1:10), а также слишком большим количеством соли или белка в образце. Это может вызвать преждевременное разделение фаз, которое можно исправить, добавив немного больше реагента TRIzol в образец. Если РНК выделена из розоватой водной фазы, велика вероятность того, что она будет загрязнена ДНК.

Вот наши рекомендации:

1. Заготовка ткани и подготовка образца ткани — по возможности, фиксируйте ткани в течение одного часа после хирургической резекции. Обширная деградация РНК может произойти до завершения процесса фиксации. Оптимальное время фиксации составляет 12-24 часа с использованием забуференного нейтрального формалина или параформальдегида. Зафиксированные ткани должны быть тщательно обезвожены до начала процесса заливки.
2. Хранение блоков — хранение блоков без срезов, когда это возможно, предотвращает продолжающееся повреждение от воздействия атмосферного кислорода, воды и других факторов окружающей среды, таких как свет и заражение (грибок, насекомые и т. д.).
3. Выбор типа ткани, размера и количества, используемых для выделения РНК, — рекомендуемая толщина ткани составляет 10-20 мкм. Количество используемых срезов определяется типом ткани (что влияет на плотность клеток) и площадью поверхности (рекомендуемый размер: 50-300 мм2). Избыток исходного материала может вызвать засорение фильтра, что приведет к плохому выходу.
4. Избегайте использования чрезмерного количества парафина для заливки тканей — по возможности, излишки парафина следует обрезать перед началом протокола очистки. Для методов очистки на основе ксилола двух обработок ксилолом при комнатной температуре должно быть достаточно для полной депарафинизации. При желании можно провести более интенсивную обработку при 37-55 градусах Цельсия в течение 30 минут. После депарафинизации ксилолом крайне важно полностью удалить 100% этанол и высушить осадок после двух промывок 100% этанолом. В методе с магнитными шариками используются новые химические вещества для работы с парафином, что ограничивает ввод до 20 мкм срезов.

Мы рекомендуем набор RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE (Cat. No. AM1975). Этот набор оптимизирован для выделения как ДНК, так и РНК из фиксированных формалином или параформалином образцов, залитых в парафин (FFPE).

Другой вариант - реагент TRIzol, но обязательно ознакомьтесь с приведенными ниже ссылками. Поскольку парафин не растворим в реагенте TRIzol, ткани, залитые парафином, можно быстро нагреть, чтобы извлечь ткань из парафина; любой оставшийся парафин всплывет на поверхность водной фазы (и его следует избегать). (Если срез очень тонкий, весь срез можно добавить в реагент TRIzol, и, надеюсь, ткань подвергнется воздействию реагента). Большинство обзоров, которые мы изучили, не содержат количественных данных, поскольку на ткани, залитые парафином, оказывают сильное влияние нуклеазы до фиксации и время фиксации формалином.

Способность обнаруживать специфические гены домашнего хозяйства с помощью ПЦР-анализа с использованием РНК или ДНК, выделенных из этих тканей, обычно считается положительным результатом. У нас нет как такового протокола, но мы разговаривали с клиентами, которые это делают. Мы рекомендуем депарафинировать с помощью ксилола (или другого органического растворителя), а затем очень тщательно измельчить образец в реагенте TRIzol (может потребоваться Polytron); в большинстве случаев вам необходимо энергично гомогенизировать, потому что ДНК сшита, и вам нужно ее освободить. Рекомендуется микроноситель, поскольку РНК сшита и фрагментирована. С этого момента можно использовать стандартный протокол выделения. Они нашли публикации, которые показывают, что успех выделения зависит от того, как долго фиксировался образец (существует обратная зависимость): Inoue, T., et. al., Pathology International (1996) Vol 46, Iss 12, pp. 997-1004.

Если известно, что образец имеет высокое содержание протеогликанов и/или полисахаридов (например, печень крысы, аорта крысы, растения), то следующая модификация этапа осаждения РНК должна удалить эти загрязняющие соединения из выделенной РНК:

- Добавьте 0,25 мл изопропанола к водной фазе, а затем 0,25 мл раствора для осаждения с высоким содержанием соли (0,8 М цитрат натрия и 1,2 М NaCl; корректировка pH не требуется) на 1 мл реагента TRIzol, использованного для гомогенизации. Смешайте полученный раствор, центрифугируйте и продолжайте выделение, как описано в протоколе.

Это модифицированное осаждение эффективно осаждает РНК и сохраняет протеогликаны и полисахариды в растворимой форме. Для выделения чистой РНК из растительного материала, содержащего очень высокий уровень полисахаридов, модифицированное осаждение следует комбинировать с дополнительным центрифугированием исходного гомогената. В целом, мы не рекомендуем осаждение с высоким содержанием соли, если загрязнение полисахаридами или протеогликанами не является проблемой, поскольку это дополнительный шаг, и в противном случае нет существенного преимущества в добавлении этого шага. При очистке образца РНК, где загрязнение полисахаридами или протеогликанами не является проблемой, общий выход РНК будет одинаковым как с высокой концентрацией соли, так и без нее. Могут быть небольшие изменения в профиле РНК, отраженные слегка уменьшенным количеством тРНК. Осаждение с высоким содержанием соли снижает содержание тРНК в образце.

Вы можете добавить гликоген в свой образец, что может помочь улучшить выход, и он останется с РНК (гликоген растворим в воде). Полиакриламид также можно использовать в качестве носителя для осаждения небольших количеств РНК. В качестве альтернативы, вы также можете использовать ДНК спермы лосося. Ее следует добавлять во время осаждения водной фазы.

Если водная фаза была удалена полностью и к образцам был добавлен этанол, он останется на поверхности реагента TRIzol из-за его более низкой плотности. Если образцы центрифугировали без перемешивания двух жидкостей, этанол останется на поверхности реагента TRIzol после центрифугирования, ДНК останется на границе раздела, а реагент TRIzol будет локализован в красной органической фракции на дне. Если этанол не был перемешан должным образом, перемешайте образцы, затем центрифугируйте и переходите к шагу 1 протокола выделения ДНК.Если случайно добавили 70% этанол, на поверхности органической фракции может появиться небольшой объем воды. Поскольку промывочные растворы, используемые в протоколе, не содержат более 30% воды, следует ожидать не более 30% от 0,3 мл (90 мкл) воды на поверхности органической фракции. Вы можете попытаться удалить и выбросить воду, прежде чем продолжить выделение. Выход ДНК может быть снижен.Это также может произойти, если разделение фаз не было полным на этапе выделения РНК. Это может произойти из-за недостаточного перемешивания хлороформа или если образцы не были центрифугированы с надлежащим ускорением, в течение необходимого времени или при правильной температуре. В результате из образца будет извлечено значительно меньше 600 мкл водной фазы РНК. Проблемы с разделением фаз обычно возникают, когда хлороформ перемешивают в пробирке вортексированием. Из-за большой разницы в плотности между реагентом TRIzol и органической фазой растворы никогда не смешиваются полностью, и будет извлечена только часть водной фазы. Когда этанол добавляется и образцы достаточно перемешиваются, разделение фаз завершится, и на поверхности образца может появиться вода.

Найдите дополнительные советы и помощь в решении проблем.

- Образец был гомогенизирован в слишком малом объеме реагента TRIzol.
- Образец не хранился при комнатной температуре в течение 5 минут после гомогенизации. (Это может привести к недиссоциации ядерных белков).
- Конечный осадок РНК не был полностью растворен. Это может произойти, если осадок РНК был пересушен (если осадок прозрачный, а не белый, это указывает на пересушивание). Чтобы осадок полностью растворился, нагрейте его до 55-60 градусов C в течение 10-15 минут и многократно пипетируйте.
- Возможно, присутствует загрязнение фенолом. Это может произойти, если образцы центрифугировали при комнатной температуре, а не при 4 градусах C; фенол более растворим в водной фазе при комнатной температуре. Если поглощение наблюдается при 270 нм (из-за фенола), образец можно осадить этанолом для удаления остаточного фенола.
- Гуанидин поглощает около 240 нм. Фенол имеет два пика: один около 275 нм, другой - широкий пик, простирающийся от менее 220 до примерно 240 нм. Если в этом диапазоне наблюдается очень большой пик, мы рекомендуем вам снова осадить и промыть. Чтобы предотвратить это, мы также рекомендуем проводить разделение фаз после добавления хлороформа при 4 градусах C.
- Может присутствовать остаточный хлороформ; повторно осадите.
- В некоторых образцах, растворенных в воде, соотношение может быть низким из-за кислотности воды или низкого содержания ионов в воде. Соотношения могут увеличиться, если образец растворен в TE, а спектрофотометр обнулен с помощью TE-буфера (или 1-3 мМ Na2HPO4, pH примерно 8.0). Молярный коэффициент экстинкции нуклеотидов задан при нейтральном pH, что предполагает, что поглощение при 260 нм будет самым высоким при нейтральном pH.
- Вариация соотношений A260/A280 с разными спектрофотометрами (кажется, что значение A280 варьируется в зависимости от того, как прибор был “обнулен” на 280 нм после “обнуления” на 260 нм). В этом случае мы предлагаем использовать другой спектрофотометр.

Часть межфазного слоя могла быть удалена вместе с водной фазой после первоначального разделения. Это может произойти по нескольким причинам.

- В образец было добавлено недостаточное количество реагента TRIzol. Как правило, следует использовать 1 мл реагента TRIzol на каждые 0,05 г ткани или каждые 10 см2 чашки.
- В исходном образце могли быть следы других органических материалов (этанол, ДМСО и т. д.).
- Перед ОТ-ПЦР РНК следует обработать ДНКазой I класса amplification grade.
- После первой гомогенизации могли остаться нерастворимые вещества, которые не были удалены центрифугированием перед экстракцией хлороформом.
- Если загрязнение ДНК было обнаружено в РНК, выделенной из клеток после трансфекции плазмидой, то не вся плазмидная ДНК могла перейти в межфазный/органический слой после добавления хлороформа к реагенту TRIzol. Если ОТ-ПЦР используется для анализа экспрессии генов из трансфицированной плазмиды, потребуется обработка ДНКазой I.

Как правило, низкое значение поглощения связано с загрязнением фенолом, которое может произойти, если образцы центрифугировали при комнатной температуре, а не при 4 градусах C. Мы рекомендуем повторное осаждение этанолом для удаления оставшегося фенола.

Вот несколько возможных причин низкого выхода/деградации ДНК:

- Образец не был полностью гомогенизирован или лизирован. Если после добавления хлороформа остается какой-либо твердый материал, это указывает на то, что выход ДНК может быть низким, поскольку ДНК останется в не гомогенизированном материале.
- Конечный осадок ДНК не был полностью растворен, поэтому убедитесь, что в качестве раствора для ресуспендирования использовался 8 мМ NaOH. Если ДНК не полностью растворена, она будет потеряна во время окончательного центрифугирования при удалении гелеобразного материала.
- Ткань не была немедленно обработана или заморожена после извлечения из животного или другого источника.
- Образцы гомогенизировали с помощью высокоскоростного гомогенизатора. Может произойти сдвиг ДНК.
- Если ожидаемый выход составляет <10 мкг, существуют ограничения на физическое действие осаждения, которые приведут к низкому выходу. В этапы гомогенизации и/или промывки можно включить микроноситель (гликоген, тРНК) или объединить образцы для увеличения ожидаемого выхода.

Пожалуйста, проверьте следующие причины низкого выхода РНК/деградировавшей РНК:

- РНК могла быть сконцентрирована с помощью системы SpeedVac или лиофилизирована после последнего осаждения этанолом. Полностью высушенная РНК имеет пониженную растворимость. Кроме того, если использовались чрезмерные скорости центрифугирования (выше 12 000 x g), сложнее растворить РНК/ДНК.
- Осадок РНК может быть не полностью растворен. Чтобы увеличить скорость растворения, многократно пипетируйте в растворе SDS или воде, обработанной DEPC, а затем нагрейте до 50-60 градусов C. Образец также мог быть богат полисахаридами или протеогликанами. В этом случае стадию осаждения изопропанолом следует проводить с 0,25 объема изопропанола и 0,25 объема раствора с высокой концентрацией соли.
- Клетки промывали перед добавлением реагента TRIzol. Промывание клеток перед добавлением реагента TRIzol увеличивает вероятность деградации мРНК.
- Образец не был полностью гомогенизирован.
- Ткань не была НЕМЕДЛЕННО обработана или заморожена после извлечения из животного или другого источника.
- Ткань не была полностью разрушена; если центрифугирование проводится до добавления хлороформа, должен быть белый слизистый осадок. Если есть осадок коричневого цвета, это свидетельствует о том, что не все клетки были лизированы.
- Если для измельчения ткани использовалась ступка и пестик, РНК и ДНК могли неспецифически прилипнуть к ступке и пестику. Лучше использовать стеклянный гомогенизатор и тефлоновый пестик; добавьте реагент TRIzol в гомогенизатор, затем добавьте замороженную ткань и гомогенизируйте.
- РНК могла храниться после выделения при -20 градусах C вместо -70 градусов C.
- Клетки тканевой культуры были разрушены трипсином.
- Слишком длительная и непрерывная гомогенизация в небольшом объеме (например, 1 мл) может привести к нагреванию образца; это может привести к деградации РНК в ткани. Образцы следует охлаждать во время гомогенизации, и гомогенизацию следует проводить циклами включения-выключения (в отличие от непрерывной).
- Показания OD могут варьироваться в зависимости от раствора, в котором хранится образец, И того, в чем он был разбавлен перед количественным определением. Это может привести к кажущемуся низкому выходу.
- Избыток стабилизирующего раствора RNAlater (>0,05 мл) снизит выход РНК и вызовет проблемы с разделением фаз.

Наиболее распространенная проблема, связанная с растворением ДНК, возникает, когда осадок ДНК пересушен. Очень важно не сушить осадок дольше 10 минут. Если вы будете следовать нашим простым рекомендациям ниже, вы сможете избежать многих проблем с растворимостью нуклеиновых кислот.

Удалите капли этанола со стенки пробирки стерильным ватным тампоном. Дополнительный этанол можно удалить, прикоснувшись к осадку кончиком стерильной капиллярной пипетки. Избыток этанола будет втянут внутрь пипетки за счет капиллярного эффекта. Остаточный этанол, который может остаться в осадке ДНК, не будет вреден. Обычно можно устранить проблемы с растворимостью ДНК, добавив 8 мМ NaOH к осадку до того, как весь этанол испарится. Осадок ДНК станет прозрачным после 5-10-минутной инкубации, когда он начнет регидратироваться. Чтобы полностью растворить ДНК, раствор необходимо несколько раз пипеткой перемешать вверх и вниз, прежде чем отбирать аликвоту для количественного определения.

Пересушенные осадки ДНК можно растворить, но может потребоваться поместить их в холодильник и периодически пипеткой перемешивать, пока они не станут прозрачными и не перейдут в раствор.

Полисахариды водорастворимы и будут распределяться в водную фазу вместе с РНК. Кроме того, осадки РНК и ДНК, содержащие загрязнители, как правило, растворяются легче, чем очень чистые осадки, если они не пересушены. Осадки, которые не растворяются в 8 мМ NaOH, также не растворятся в растворе фенола/хлороформа.

Существует два способа удаления нерастворимого материала:

1. Только для выделения РНК: Если после гомогенизации и 5-минутной инкубации при комнатной температуре образуется большое количество нерастворимого материала, удалите его центрифугированием при 12 000 x g в течение 10 минут при 4 градусах C перед добавлением хлороформа (должен наблюдаться прозрачный супернатант и желеобразный осадок). Отберите супернатант и переходите к следующему шагу. Примечание: Это не следует делать, если планируется последующее выделение ДНК.
2. Выделение РНК и ДНК: Если после гомогенизации и 5-минутной инкубации при комнатной температуре образуется большое количество нерастворимого материала, гомогенат можно пропустить через полипропиленовую сетку, чтобы удалить нерастворимый материал, который может помешать осаждению ДНК.

Да, одноцепочечная ДНК будет отделяться в фазе ДНК.

Фенольную фазу и межфазный слой можно хранить при 4 градусах C в течение ночи. Образцы также можно хранить в промывочном растворе (0,1 М цитрат натрия в 10% этаноле) в течение как минимум нескольких часов. Образцы также можно суспендировать в 75% этаноле при 4 градусах C в течение нескольких месяцев.

Мы предлагаем реагент TRIzol, который позволит выделить ДНК и РНК из одного и того же образца. Альтернативно, у нас есть следующий метод, который был валидирован нашей командой R&D; для последовательного выделения гДНК и тотальной РНК из одного и того же образца. Этот метод включает использование 2 наших наборов: 1) PureLink RNA Mini Kit (Cat. No. 12183018A, 12183020, 12183025) и 2) PureLink Genomic DNA Mini Kit (Cat. No. K182002, K182000, K182001).

Протокол подробно описан ниже:

Перед началом:
- Пометьте все спиновые колонки и буферы из каждого набора названиями наборов, чтобы избежать путаницы.
- Приготовьте лизирующий буфер и промывочные буферы в соответствии с протоколом из каждого набора.
1. Подготовка лизатов:
- Добавьте 300 мкл лизирующего буфера (из Purelink RNA Mini Kit, с добавлением бета-меркаптоэтанола) к образцу клеток или ткани, лизируйте клетки в соответствии с рекомендациями.

2. Выделение ДНК:
- Нанесите весь лизат непосредственно на колонку Purelink gDNA (из PureLink Genomic DNA Mini Kit), сохраните проток для выделения РНК.
- Центрифугируйте колонку Purelink gDNA при 10 000 x g в течение 1 мин.
- Промойте колонку Purelink gDNA 500 мкл промывочного буфера 1 (из PureLink Genomic DNA Mini Kit, с добавлением этанола), центрифугируйте при 10 000 x g в течение 1 мин.
- Добавьте 500 мкл промывочного буфера 2 (из PureLink Genomic DNA Mini Kit, с добавлением этанола), центрифугируйте на максимальной скорости в течение 3 мин для высушивания мембраны.
- Добавьте 100 мкл элюирующего буфера (из PureLink Genomic DNA Mini Kit), инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 мин и центрифугируйте при 10 000 x g в течение 1 мин (выход можно увеличить, если добавить дополнительную вторую стадию элюции).
- Это очищенная гДНК.

3. Выделение РНК:
- К сохраненному выше протоку добавьте такой же объем 70% этанола, хорошо перемешайте и нанесите смесь лизата/этанола (включая все осадки) на спиновый картридж для РНК (из Purelink RNA Mini Kit).
- Центрифугируйте при 12 000 x g в течение 15 сек. Выбросьте проток.
- Промойте спиновый картридж для РНК 700 мкл промывочного буфера 1 (из Purelink RNA Mini Kit, с добавлением этанола), центрифугируйте при 12 000 x g в течение 15 сек.
- Промойте дважды 500 мкл промывочного буфера 2 (из Purelink RNA Mini Kit, с добавлением этанола). После второй промывки центрифугируйте при 12 000 x g в течение 1 мин для высушивания мембраны.
- Добавьте 50 мкл воды, свободной от РНКазы, на спиновый картридж для РНК, инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 мин и центрифугируйте при 12 000 x g в течение 2 мин (выход можно увеличить, если добавить дополнительную вторую стадию элюции).
- Это очищенная РНК.

Да, использовались скорости центрифугирования от 5 000 до 6 000 x g, но время центрифугирования следует удвоить, чтобы получить ожидаемый выход.

Дополнительные советы можно найти в наших материалах.

Если было случайно добавлено большое количество хлороформа, вы можете добавить больше TRIzol Reagent, чтобы поддерживать соотношение 0.2 мл хлороформа:1 мл TRIzol Reagent. Если добавлено слишком много хлороформа, это может переместить ДНК, и в конечном итоге белок, в водную фазу.

Если на этом этапе вместо хлороформа был случайно добавлен изопропанол, добавьте больше изопропанола, чтобы осадить все, затем ресуспендируйте осадок в реагенте TRIzol и используйте протокол, как указано. Выход РНК будет снижен, но, возможно, удастся получить продукт в ОТ-ПЦР. Подробный протокол приведен ниже:

(1) Добавьте больше изопропанола, чтобы общий объем изопропанола был равен объему использованного реагента TRIzol. Центрифугируйте при 7500 x g в течение 10 мин при 4 градусах C.
(2) Слейте супернатант; дайте относительно плотному осадку высохнуть на воздухе (не обязательно полностью, просто уменьшите объем изопропанола).
(3) Оцените размер осадка в микролитрах; добавьте не менее 15–20 объемов реагента TRIzol (например, для осадка объемом 100 мкл добавьте не менее 1,5 мл реагента TRIzol).
(4) Хорошо разбейте осадок (возможно, вам придется использовать ручной гомогенизатор). Храните раствор в течение 10–15 мин. при комнатной температуре; примерно каждые 5 мин встряхивайте его вручную, чтобы он хорошо диспергировался.
(5) Продолжайте работу с реагентом TRIzol в соответствии с письменным протоколом (т. е. добавьте хлороформ). Результаты не будут оптимальными, но, возможно, удастся получить продукт в ОТ-ПЦР.

Гликоген можно добавить к вашему образцу для повышения выхода, он останется с РНК (гликоген растворим в воде). Полиакриламид также можно использовать в качестве носителя для осаждения небольших количеств РНК.

Найдите дополнительные советы и помощь в решении проблем.

В протоколе экстракции РНК есть несколько возможных точек остановки, как показано ниже:

•После гомогенизации (до добавления хлороформа) образцы можно хранить при 4 градусах C в течение ночи или при –70 градусах C не менее 1 года.
•Гомогенизированные образцы могут находиться при комнатной температуре несколько часов до добавления хлороформа.
•Гомогенизированные образцы можно размораживать и повторно замораживать перед использованием (необходимо, когда исследователь намеревается провести эксперимент, но затем не может продолжить).
•После осаждения РНК, во время промывки РНК, РНК можно хранить в 75% этаноле не менее 1 года при –20 градусах C или не менее 1 недели при 4 градусах C.

Для экстракции ДНК фенольную фазу и межфазный слой можно хранить при 4 градусах C в течение ночи перед осаждением ДНК. Некоторые клиенты пробовали хранить при 4 градусах C в течение недели и при –20 градусах C в течение года и все еще получали хорошее восстановление.

Найдите дополнительные советы и помощь в устранении неполадок.

Вы можете гомогенизировать свой образец с помощью стеклянного тефлонового или мощного гомогенизатора (Polytron или Tissumizer от Tekmar) в пробирке для микроцентрифуги объемом 1,5 мл. Культивируемые клетки не обязательно гомогенизировать. Ультразвуковая обработка подходит для лизиса клеток в реагенте TRIzol, но ее следует проводить только в том случае, если вы не планируете выделять ДНК из вашего образца. Клетки, выращенные в монослоях, можно лизировать непосредственно в чашке для культивирования.

TRIzol Reagent содержит фенол и изотиоцианат гуанидина, которые позволяют выделять нуклеиновые кислоты из белков. Дальнейшее разделение нуклеиновых кислот происходит в зависимости от pH. При pH 7.0 или выше ДНК и РНК переходят в водную фазу. При кислом pH, ниже 7.0, ДНК денатурирует и переходит в органическую фазу (межфазный слой), при этом РНК остается в водной фазе. pH TRIzol Reagent составляет около 5.

Да, ткань, хранящаяся в реагенте RNAlater, может быть использована в реагенте TRIzol. Извлеките ткань из реагента RNAlater и немедленно погрузите в раствор TRIzol.

TRIzol LS Reagent — это более концентрированная формула, позволяющая использовать меньшее количество реагента по отношению к образцу. LS означает жидкие образцы. TRIzol LS Reagent разработан с уменьшенным объемом воды, что позволяет добавлять больший объем образца к меньшему объему реагента. Следовательно, при использовании реагентов TRIzol и TRIzol LS в соответствии с их соответствующими протоколами они будут работать идентично и содержать одинаковое количество хаотропных агентов. Два реагента можно различить по цвету: TRIzol LS Reagent имеет более темный, бордово-красный цвет, а TRIzol Reagent — более светлый.

TRIzol LS Reagent – это готовый к использованию реагент для легкого и одновременного выделения тотальной РНК, ДНК и белков из жидких образцов. Этот реагент, однофазный раствор фенола и тиоцианата гуанидиния, представляет собой усовершенствование одношагового метода выделения РНК, разработанного Chomzcynski и Sacchi. TRIzol LS Reagent схож с оригинальным TRIzol Reagent по составу и результатам использования. TRIzol LS Reagent предназначен для использования с жидкими образцами, такими как кровь и вирусные препараты, в которых необходимо обрабатывать большие объемы водных образцов, в то время как TRIzol Reagent предназначен для клеточных культур или тканей. Он разработан для обработки большего количества жидкого образца на единицу реагента по сравнению с оригинальной формулой.

Единственное различие между TRIzol Reagent и TRIzol LS Reagent – концентрация компонентов. TRIzol LS Reagent немного более концентрированный. Формула позволяет использовать меньшее количество реагента по отношению к жидкому образцу. (TRIzol = требуется 10:1, TRIzol LS = требуется 3:1). Если вы покупаете TRIzol LS Reagent, но хотите использовать его как TRIzol Reagent (на твердых образцах), вероятно, произойдет снижение выхода по сравнению с использованием обычного TRIzol Reagent. TRIzol LS Reagent НЕ следует использовать в неразбавленном виде с твердыми образцами. Для разбавления: возьмите 750 мкл TRIzol LS Reagent + (50–100 мг ткани + воду до 250 мкл).

TRI означает Total RNA Isolation (Тотальная изоляция РНК). Это также указывает на то, что этот реагент можно использовать для очистки РНК, ДНК и белков из одного источника.

Реагент TRIzol – это готовая к использованию смесь фенола, изотиоцианата гуанидина, красного красителя и других запатентованных компонентов.

Наш реагент TRIzol (кат. № 15596026) позволяет выделить РНК, ДНК и белок из одного и того же образца.

Да, можно. Вот ссылка на статью, а также краткое описание метода из статьи.

Genes to Cells (2001) 6:121-129 (под заголовком 'Выделение РНК и ОТ-ПЦР')

Реагент TRIzol LS (LifeSciences) использовали в соответствии с инструкциями производителя для экстракции тотальной РНК из фракций сахарозного градиента. Вкратце, 250 мкл каждой фракции добавляли к 750 мкл реагента TRIzol LS и энергично встряхивали в течение 15 секунд. После 10-минутной инкубации при комнатной температуре добавляли 150 мкл хлороформа, после чего следовало энергичное встряхивание и кратковременная инкубация при комнатной температуре. Затем образцы центрифугировали при 14 000 g в течение 10 минут в настольной микроцентрифуге. Пять микрограммов гликогена, свободного от нуклеаз, добавляли к 300 мкл водной фазы, и нуклеиновые кислоты осаждали добавлением равного объема 2-пропанола. После центрифугирования при 14 000 g в течение 30 минут при комнатной температуре осадок один раз промывали 75% этанолом и ресуспендировали в 20 мкл стерильной воды, свободной от нуклеаз. Пять микролитров тотальной РНК использовали в качестве субстрата для синтеза кДНК со случайным праймированием с использованием модифицированной обратной транскриптазы MMLV Superscript II (Gibco/Life Sciences).

Кровь, собранная с EDTA, обычно имеет самое высокое содержание ДНК, кровь, собранная с гепарином, обычно имеет меньшее содержание, чем собранная с EDTA, а кровь, собранная с цитратом, показывает наименьшее загрязнение ДНК из этих трех. (Состав раствора цитрата: 3,8% (вес/объем), что составляет 3,8 г/100 мл воды. Используйте 0,5 мл на каждые 4,5 мл крови. Осторожно покачивайте вперед-назад после добавления раствора цитрата для перемешивания.) Добавление 12 мкл 5 N уксусной кислоты на миллилитр реагента TRIzol может помочь, хотя проблема с загрязнением ДНК все еще может оставаться. Лучше всего использовать плазму или сыворотку. Чем свежее образец крови, тем лучше РНК. Деградация РНК наблюдалась в крови, которая была обработана всего через два часа после взятия.

Найдите дополнительные советы, помощь в решении проблем и ресурсы.

Есть несколько причин, по которым водная фаза может казаться розоватой. Это может быть связано с используемой тканью. Это часто встречается в образцах кожи. Предполагается, что в этих образцах есть жир, и жировые мицеллы “пытаются подняться к вершине пробирки” во время центрифугирования, но не могут этого сделать. В образцах кожи мицеллы захватывают пигмент меланина, и водная фаза окрашивается. Жировые мицеллы также могут захватывать пигмент из самого реагента TRIzol, что приводит к розоватому цвету. Если предполагается, что образец содержит жир, гомогенат образца в реагенте TRIzol можно центрифугировать до добавления хлороформа. Жир будет выглядеть как прозрачный слой в верхней части супернатанта; его следует отбирать пипеткой и выбрасывать.

Кроме того, если образец содержит много крови, водная фаза может казаться мутной и/или желтоватой (это может быть связано с выделением железа из гемоглобина).

Если используемая центрифуга не холодная, органическая фаза будет иметь более насыщенный бордовый цвет; часть этого цвета может перейти в водную фазу и придать ей оранжевый или желтый оттенок.

В качестве альтернативы, розоватая водная фаза может быть вызвана чрезмерным разбавлением образца (т.е. соотношение образец:реагент TRIzol больше 1:10), а также слишком большим количеством соли или белка в образце. Это может вызвать преждевременное разделение фаз, которое можно исправить, добавив немного больше реагента TRIzol в образец. Если РНК выделена из розоватой водной фазы, велика вероятность ее загрязнения ДНК. Хотя это не должно быть существенным, поскольку реагент TRIzol разработан для предотвращения преждевременного разделения фаз.

Если вам не нужно будет выделять геномную ДНК из того же образца и вы хотите снизить вероятность загрязнения РНК геномной ДНК, вам следует выполнить необязательный этап центрифугирования, упомянутый в шаге 1 руководства по реагенту TRIzol, до добавления хлороформа.

После тщательной гомогенизации образца в реагенте TRIzol центрифугируйте образец при 12 000 X g в течение 10 минут при 4 градусах C. Геномная ДНК, клеточные мембраны и полисахариды образуют осадок, а ваша РНК будет находиться в супернатанте. Любые липиды и жиры в вашем образце также могут образовывать слой в верхней части раствора. Удалите слой жира при необходимости стерильным инструментом и перенесите РНК-супернатант в новую пробирку. Выбросьте осадок ДНК.

Добавьте хлороформ к РНК-супернатанту и продолжите протокол выделения РНК.

Чтобы еще больше снизить загрязнение гДНК, вы можете обработать вашу РНК после выделения ДНКазой I амплификационного качества. (Не рекомендуется использовать ДНКазу I неамплификационного качества, поскольку она не проверена на отсутствие РНКаз и, как было показано, в некоторых случаях разрушает образцы РНК.)

Добавьте 10 микрограмм свободного от РНКаз гликогена к ткани массой менее 10 мг или к суспензионным клеткам в количестве менее 1 X 10e6. В отличие от ДНК спермы лосося, гликоген можно добавлять при добавлении реагента TRIzol к образцу.

Дополнительные советы и информацию можно найти онлайн.

Осаждение полисахаридов (а также осаждение геномной ДНК): После гомогенизации, перед добавлением хлороформа, центрифугируйте при 12 000 X g при 4 градусах C в течение 10 минут для осаждения полисахаридов. Кроме того, вам может потребоваться выполнить осаждение в изопропаноле с высоким содержанием соли следующим образом.

После сбора водной фазы добавьте 0,25 мл изопропанола и 0,25 мл 0,8 M цитрата натрия, 1,2 M NaCl на 1 мл реагента TRIzol. Перемешайте раствор, центрифугируйте и продолжите выделение, как описано. Это осаждает РНК и поддерживает протеогликаны и полисахариды в растворимой форме. Известно, что образцы с высоким содержанием протеогликанов или полисахаридов включают печень крысы, аорту крысы и растения.

Да. У нас был успешный опыт выделения РНК из 10⁴ клеток с использованием 0,4 мл реагента TRIzol. При осаждении РНК добавьте 5-10 мкг гликогена, свободного от РНКазы, в качестве носителя в водную фазу.

Да. Масштабируйте линейно для тканей и клеток в суспензии. Для монослойных клеток масштабируйте линейно на основе площади поверхности планшета, а НЕ количества клеток. Используйте не менее 1 мл реагента TRIzol на каждые 10 см² площади поверхности.

Найдите дополнительные советы и помощь в устранении неполадок.

РНК, растворенную в деионизированном формамиде, можно хранить при -70 градусах C до 1 года. Для осаждения РНК из формамида добавьте NaCl до конечной концентрации 0.2 М, затем 4 объема этанола. Инкубируйте 3-5 мин при комнатной температуре и центрифугируйте при 10 000 x g в течение 5 мин.

Используйте полипропиленовые пробирки. Не используйте пробирки, чувствительные к фенолу.

Да, используйте 2600 X g при 4 градусах Цельсия в течение 60 минут для разделения фаз и 30 минут для осаждения РНК.

Найдите дополнительные советы, помощь в устранении неполадок и ресурсы в нашем .

Осадок ДНК, полученный после осаждения изопропанолом, легко смещается при промывке 70% этанолом. Лучше всего удалять надосадочную жидкость изопропанола и этанольный промывочный раствор пипетированием. Будьте осторожны и не направляйте промывочный буфер непосредственно на осадок. Вместо этого дайте промывочному буферу стечь по осадку. Независимо от того, какой набор для минипрепаратов от производителя вы используете, промывка осадка может быть затруднительной, поскольку он очень мал.

Около 60% объема реагента TRIzol становится частью водной фазы после добавления хлороформа.

Да. Однако, поскольку ДНК растворена в 8 мМ NaOH, необходимо скорректировать pH с помощью HEPES. В зависимости от эндонуклеазы рестрикции, используйте от 3 до 6 единиц на µг ДНК в течение от 3 часов до ночи. В типичном анализе переваривается от 80 до 90% ДНК.

В реагенте TRIzol уже есть компоненты, которые действуют как пеногасители. Добавление других пеногасителей не тестировалось. Если вы попытаетесь добавить другие компоненты, вы можете столкнуться с более высоким уровнем контаминации ДНК. Если вы работаете с очень маленькими образцами, мы можем предложить использовать немного больший объем реагента TRIzol, чтобы минимизировать потерю образца при гомогенизации. Конечно, как всегда, будьте осторожны при добавлении чего-либо в реагент для очистки РНК, поскольку деградация РНК всегда является проблемой.

Существует несколько продуктов Thermo Fisher Scientific, которые можно использовать для очистки РНК из растений. Они перечислены в алфавитном порядке:

Реагент для выделения РНК из растений (Plant RNA Isolation Reagent).
--Реагент Plant RNA предназначен для выделения РНК с высоким выходом из растительных образцов, даже сложных, таких как хвойные и семена растений. Этот реагент хорошо удаляет фенольные соединения и крахмал.

Реагенты TRIzol и TRIzol LS.
--Реагент TRIzol - хороший выбор, если ткань не слишком водянистая (например, фрукты), в этом случае рекомендуется использовать реагент TRIzol LS. При использовании реагента TRIzol с растительной тканью мы рекомендуем гомогенизировать 15 мг (общий вес) листа стеклянным гомогенизатором в 1 мл реагента TRIzol. Далее следуйте протоколу. В пуансеттии мы наблюдали 33 мкг РНК из 45 мг ткани (0,7 мкг/мл), а из табака - 76 мкг РНК из 100 мг ткани (0,8 мкг/мл).

Особые рекомендации по осаждению РНК из ткани, содержащей большое количество протеогликанов и/или полисахаридов (как у растений): добавьте к водной фазе 0,25 мл изопропанола, а затем 0,25 мл высокосолевого раствора для осаждения (0,8 М цитрата натрия и 1,2 М NaCl) на 1 мл реагента TRIzol, использованного для гомогенизации. Перемешайте полученный раствор, центрифугируйте и продолжайте выделение, как описано в протоколе. Модифицированное осаждение эффективно осаждает РНК и поддерживает протеогликаны и полисахариды в растворимой форме. Эту процедуру следует использовать ТОЛЬКО в том случае, если известно, что образец имеет высокое содержание протеогликанов и полисахаридов. Для выделения чистой РНК из растительного материала, содержащего очень высокий уровень полисахаридов, модифицированное осаждение следует сочетать с дополнительным центрифугированием исходного гомогената.

Особые рекомендации по осаждению РНК из листьев хлопка: Выход из 100 мг ткани был почти нулевым. Мы отметили, что выход ДНК из листьев хлопка составляет от 1/6 до 1/3 от выхода ДНК из других растений, поэтому может существовать корреляция и с выходом РНК. Попробуйте использовать в 3–5 раз больше ткани и микроноситель, а также предварительное центрифугирование (перед хлороформом) и модифицированное (высокосолевое) осаждение. Кроме того, рН некоторых растений при гомогенизации в реагенте TRIzol изменится; он должен составлять 5,5 (измерение с помощью pH-метровой бумаги достаточно точно). Если он выше, отрегулируйте с помощью ледяной уксусной кислоты.

Реагент TRIzol продемонстрировал стабильность в течение 12 месяцев при хранении при комнатной температуре. Однако мы рекомендуем хранить его при температуре от 2 до 8 градусов C для оптимальной производительности.

Соотношения реагента к образцу для реагента TRIzol (Кат. № 15596026) и реагента TRIzol LS (Кат. № 10296010) следующие:

• Для реагента TRIzol LS - 3:1 (0.75 мл реагента TRIzol LS с 0.25 мл образца)
• Для реагента TRIzol - 10:1 (объем образца не должен превышать 10% от объема реагента TRIzol)

Реагент TRIzol LS — это готовый к использованию реагент для простого и одновременного выделения тотальной РНК, ДНК и белков из жидких образцов. Реагент TRIzol LS похож на оригинальный реагент TRIzol по составу и результатам использования. Реагент TRIzol LS предназначен для использования с жидкими образцами, такими как кровь и вирусные препараты, в которых необходимо обрабатывать большие объемы водных образцов, в то время как реагент TRIzol предназначен для клеточных культур или тканей.

Единственная разница между реагентом TRIzol и реагентом TRIzol LS - концентрация компонентов. Реагент TRIzol LS немного более концентрированный. Формула позволяет использовать меньшее количество реагента по отношению к жидкому образцу (например, TRIzol = требуется 10:1, TRIzol LS = требуется 3:1). Если вы хотите использовать реагент TRIzol LS с твердыми образцами, вероятно, произойдет снижение выхода по сравнению с использованием обычного реагента TRIzol. Реагент TRIzol LS не следует использовать в неразбавленном виде с твердыми образцами. Для разбавления возьмите 750 µL реагента TRIzol LS + (50-100 мг ткани + вода до 250 µl).

Во всех наших наборах для выделения РНК на основе TRIzol, включая пробирки Phasemaker (кат. № A33248), предусмотрен этап разделения фаз на основе хлороформа, который нельзя пропустить.

Вы можете хранить гомогенизированные образцы при 4°C в течение ночи или при -20°C до года. См. здесь.

Нет, хранение реагента TRIzol при комнатной температуре в течение ночи не повлияет на его стабильность. Условия хранения реагента при 4 градусах Цельсия облегчают его использование в приложениях для экстракции РНК, где необходимо поддерживать низкую температуру.

Скорее всего, образец был гомогенизирован в недостаточном объеме реагента TRIzol. Убедитесь, что вы добавляете соответствующее количество реагента TRIzol для вашего типа образца.
В качестве альтернативы, органическая фаза могла быть удалена не полностью. Не пытайтесь отобрать весь водный слой после разделения фаз.

Скорее всего, интерфаза/органическая фаза была отпипетирована вместе с водной фазой. Не пытайтесь отобрать весь водный слой после разделения фаз.

Скорее всего, образец не был немедленно обработан или заморожен сразу. Вы должны обрабатывать образцы немедленно или замораживать их. Храните образцы РНК при температуре от -60 до -70 градусов Цельсия. Храните образцы ДНК и белка при температуре -20 градусов Цельсия.

Более низкий выход может указывать на то, что образцы могли быть не полностью гомогенизированы или лизированы. Вы можете уменьшить количество исходного материала или разрезать образцы ткани на более мелкие кусочки и убедиться, что ткань полностью погружена в реагент TRIzol. В качестве альтернативы, осадок мог быть не полностью растворен. Если есть подозрения на это, нагрейте образец до 50-60 градусов C и многократно пипетируйте его.