Dynabeads™ mRNA DIRECT™ Purification Kit, 10 mL

Пожалуйста, проверьте следующие возможные причины, по которым ваши магнитные шарики Dynabeads плохо осаждаются:

- Раствор слишком вязкий.
- Шарики образовали агрегаты из-за белок-белкового взаимодействия.

Попробуйте следующие предложения: - Увеличьте время разделения (оставьте пробирку на магните на 2–5 минут)
- Добавьте ДНКазу I в лизат (~0.01 мг/мл)
- Увеличьте концентрацию Tween 20 до ~0.05% в связывающем и/или промывочном буфере.
- Добавьте до 20 мМ бета-меркаптоэтанола в связывающие и/или промывочные буферы.

Существует несколько причин, по которым может возникнуть загрязнение ДНК:

- Неполное фрагментирование ДНК.
- Неполное удаление лизата образца после этапа гибридизации.
- Недостаточная промывка и/или удаление промывочных буферов.
- Слишком высокое соотношение образца к шарикам.

Для биотинилированной ДНК размером менее 1 т.п.н. мы рекомендуем использовать Dynabeads M270 Streptavidin и магнитные бусины MyOne C1. Мы рекомендуем наш набор Dynabeads KilobaseBINDER Kit, который предназначен для иммобилизации длинных (более 1 т.п.н.) двухцепочечных молекул ДНК. Реагент KilobaseBINDER состоит из магнитных бусин Dynabeads M-280 Streptavidin и запатентованного активатора иммобилизации в связывающем растворе для связывания с длинными биотинилированными молекулами ДНК для выделения. Для получения дополнительной информации о выделении длинных биотинилированных фрагментов ДНК.

Да, магнитные гранулы Dynabeads можно использовать для выделения одноцепочечной ДНК. Магнитные гранулы Streptavidin Dynabeads можно использовать для связывания биотинилированных фрагментов ДНК с последующей денатурацией двухцепочечной ДНК и удалением небиотинилированной цепи. Стрептавидин-конъюгированные магнитные гранулы Dynabeads не ингибируют ферментативную активность. Это позволяет в дальнейшем обрабатывать и манипулировать ДНК, связанной с гранулами, непосредственно на твердой фазе.

Магнитная восприимчивость — это мера того, как быстро частицы мигрируют к магниту. Это зависит от содержания железа и характера оксида железа. Магнитная восприимчивость, указанная для магнитных частиц Dynabeads, является массовой магнитной восприимчивостью, выраженной либо в единицах СГС/г, либо в м^3/кг (последняя является единицей СИ). Для ферри- и ферромагнитных веществ массовая магнитная восприимчивость зависит от напряженности магнитного поля (H), поскольку намагниченность таких веществ не является линейной функцией H, а приближается к значению насыщения с увеличением поля. По этой причине массовая магнитная восприимчивость магнитных частиц Dynabeads определяется стандартизированной процедурой в фиксированных условиях. Таким образом, массовая магнитная восприимчивость, указанная в нашем каталоге, выражена в единицах СИ. Преобразование из гауссовых (СГС, emu) единиц в единицы СИ для массовой магнитной восприимчивости достигается путем умножения гауссова фактора (emu/г или СГС/г) на 4 pi x 10^-3. Полученная единица также называется рационализированной массовой магнитной восприимчивостью, которую следует отличать от (СИ) безразмерной единицы магнитной восприимчивости. В общем, массовая магнитная восприимчивость — это мера силы (Fz), воздействующей на объект, расположенный в неоднородном магнитном поле. Массовая магнитная восприимчивость магнитных частиц Dynabeads измеряется путем взвешивания образца, а затем подвергая образец воздействию магнитного поля известной силы. Затем измеряется вес (F1) и сравнивается с весом образца, когда магнитное поле выключено (F0). Затем восприимчивость вычисляется как K x 10^-3 = [(F1-F0) x m x 0.335 x 10^6], где K - массовая восприимчивость образца массой m. Затем восприимчивость преобразуется в единицы СИ.

Существуют различные методы проверки связывания лигандов с частицами, включая измерение оптической плотности (OD), флуоресцентное мечение и радиоактивное мечение.

Для измерения OD необходимо измерить OD лиганда до иммобилизации на частицах и сравнить его с концентрацией лиганда, оставшейся в супернатанте после покрытия. Это дает приблизительное представление о том, сколько белка связалось с частицами.

Протокол:

1. Установите спектрофотометр на нужную длину волны. В качестве бланка используйте буфер для связывания.
2. Измерьте абсорбцию раствора до связывания. Может потребоваться дальнейшее разведение для считывания абсорбции, в зависимости от количества добавленного лиганда.
3. Измерьте абсорбцию раствора после связывания. Для считывания абсорбции может потребоваться разведение.
4. Рассчитайте эффективность связывания, выраженную в % поглощения белка, следующим образом. [(Раствор до связывания x D) - (Раствор после связывания x D)] x 100/(Раствор до связывания x D), где D = коэффициент разведения.

Для флуоресцентного мечения мы рекомендуем отрицательно количественно определять количество связанного лиганда путем измерения лиганда, оставшегося в супернатанте после связывания (по сравнению с исходным образцом), а не путем непосредственного измерения лигандов на частицах. Добавьте меченый лиганд к частицам и измерьте, сколько лиганда осталось в супернатанте (не связано с частицами). Сравнив это с общим количеством, добавленным изначально, вы можете рассчитать, сколько лиганда связалось с частицами. Имейте в виду, что магнитные частицы Dynabeads также обладают собственной флуоресценцией, поэтому не рекомендуется прямое измерение флуоресценции лигандов, связанных с частицами, а скорее этот косвенный подход. Метка может быть, например, FITC/PE. Некоторые исследователи успешно используют прямой подход (с помощью проточного цитометра).

Радиоактивное мечение является наиболее чувствительным из трех методов, но и самым сложным. Он включает в себя радиоактивное мечение части лиганда. Мы используем радиоактивно меченный I-125 в следовых количествах и смешиваем его с «холодными» лигандами в известном соотношении перед связыванием. Абсолютные количества лиганда на частицах следует получать путем измерения частиц в сцинтилляционном (гамма) счетчике и сравнения cpm со стандартом.

Протокол:

1. Возьмите необходимое количество частиц и промойте их в 1 мл связывающего буфера.
2. Пипеткой перенесите желаемое количество человеческого IgG в отдельную пробирку.
3. Смешайте человеческий IgG с человеческим IgG, меченным I-125 (30 000 - 100 000 cpm).
4. Разведите смесь человеческого IgG и человеческого IgG, меченного I-125, до 100 мл в связывающем буфере.
5. Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре и измерьте cpm в сцинтилляционном счетчике.
6. Промойте частицы (с покрытием) четыре раза и снова измерьте cpm.
% связывания рассчитывается по формуле: (cpm после промывки/cpm до промывки)x100%.

Магнитные частицы Dynabeads доступны в трех размерах: 4,5 мкм (M-450), 2,8 мкм (M-270/M-280) и 1 мкм (частицы MyOne). Самые крупные магнитные частицы Dynabeads идеально подходят для больших мишеней, таких как клетки. Частицы размером 2,8 мкм рекомендуются для протеомики и молекулярных применений. Самые маленькие частицы, 1 мкм, идеально подходят для автоматизированной обработки.

В целом, кратковременная обработка ультразвуком – хороший способ уменьшить агрегацию шариков и обеспечить оптимальные однородные условия во время добавления лиганда при покрытии шариков. Когда мишень связана с шариками, требуется большая осторожность, так как связывание может нарушиться. Сами стрептавидиновые шарики должны выдерживать обработку ультразвуком. Мы не тестировали обработку ультразвуком в течение длительного времени, но 5 минут – это нормально. У нас нет информации о том, что взаимодействие стрептавидин-биотин нарушается такой обработкой.

При желании, непокрытые эпоксидные или тозилактивированные частицы можно стерилизовать промыванием 70% этанолом. Покрытые частицы стерилизовать нельзя.

Магнитные бусины Dynabeads представляют собой однородные, непористые, суперпарамагнитные, монодисперсные и с высокой степенью сшивания полистирольные микросферы, состоящие из равномерного распределения магнитного материала по всей бусине. Магнитный материал внутри магнитных бусин Dynabeads состоит из смеси маггемита (гамма-Fe2O3) и магнетита (Fe3O4). Содержание железа (Fe) в бусинах составляет 12% по весу в магнитных бусинах Dynabeads M-280 и 20% по весу в магнитных бусинах Dynabeads M-450. Магнитные бусины Dynabeads покрыты тонкой полистирольной оболочкой, которая заключает в себе магнитный материал и предотвращает любую утечку из бусин или захват лигандов внутри бусины. Оболочка также защищает мишень от воздействия железа, обеспечивая при этом определенную площадь поверхности для адсорбции или связывания различных молекул.

Однородность размера и формы бусин обеспечивает стабильные физические и химические свойства. Эти однородные физические характеристики приводят к высококачественным, воспроизводимым результатам.

Магнитные бусины Dynabeads доступны в трех различных размерах: 4,5 µm (бусины M-450), 2,8 µm (бусины M-270/M-280) и 1 µm (бусины MyOne).

Вот некоторые источники по библиотекам кДНК и ОТ-ПЦР:

Jakobsen KS, Haugen M, Sæbøe-Larssen S, Hollung K, Espelund M, Hornes E. Direct mRNA isolation using Magnetic Oligo (dT) Beads: A protocol for all types of cell cultures, animal and plant tissues. In Advances in Biomagnetic Separation, Ed Uhlén, M., Hornes, E., Olsvik Ø., Eaton Publishing. 1994:61-72

Raineri I, Moroni C, Senn HP. Improved efficiency for single-sided PCR by creating a reusable pool of first-strand cDNA coupled to a solid phase. Nucleic Acids Research 1991;19:4010

Raineri I, Senn HP. HIV-1 promotor insertion revealed by selective detection of chimeric provirus-host gene transcripts. Nucleic Acids Res. 1992;20:6261-6266

Sharma P, Lönneborg A, Stougaard P. PCR-based construction of subtractive cDNA library using magnetic beads. BioTechniques 1993;15:610-611

Lee Y-H, Vacquier VD. Reusable cDNA libraries coupled to magnetic beads. Anal. Biochem. 1992;206:206-207

Lambert KN, Williamson VM. cDNA library construction from small amounts of RNA using paramagnetic beads and PCR. Nucleic Acids Research 1993;21:775-776

Aasheim H-C, Deggerdal A, Smeland EB, Hornes E. A simple subtraction method for the isolation of cell- specific genes using magnetic monodisperse polymer particles. BioTechniques 1994;16:716-721

Coche T, Dewez M, Beckers M-C. Generation of an unlimited supply of a subtracted probe using magnetic beads and PCR. Nucleic Acid Research 1994;22:1322-1323

Rodriguez IR, Chader GJ. A novel method for the isolation of tissue-specific genes. Nucleic Acids Research 1992;20:3528

Schraml P, Shipman R, Stulz P, Ludwig CU. cDNA subtraction library construction using a magnet-assisted subtraction technique (MAST). Trends in Genetics 1993;3:70-71

Wada H, Asada M, Miyazaki M, Ilda S, Mizutani S. Application of oligo (dT) Dynabeads for the molecular diagnosis of human leukemia. The John Uglestad Conference I: Magnetic separation techniques applied to cellular and molecular biology, 1991

Larsen F, Solheim J, Kristensen T, Kolstø AB, Prydz H. A tight cluster of five unrelated human genes on chromosome 16q22.1. Human Molecular Genetics 1993;2:1589-1595

Цель этого этапа (нагревание при 65 градусах C в течение 5 минут) - раскрыть вторичные структуры в РНК. Если вы хотите использовать Oligo(dT)25 на бусинах в качестве праймеров для синтеза кДНК и получить кДНК в твердой фазе, вам следует пропустить этот этап. Начните с 50 градусов C (иначе мРНК отделится от бусин), а затем перейдите к этапу с 65 градусами C.

Получение полноразмерной кДНК из мРНК, прикрепленной к магнитным шарикам Dynabeads, возможно. Мы рекомендуем термостабильный набор для обратной транскрипции, чтобы можно было преодолеть сложные участки с GC-богатыми вторичными структурами. Однако начать реакцию путем нагревания мРНК на шариках невозможно, так как это приведет к элюированию мРНК (базовые пары A:T наименее термостабильны).

Буква M означает магнитные. M-280 обозначает гидрофобные бусины размером 2,8 микрона, а M-270 обозначает гидрофильные бусины размером 2,8 микрона. MyOne обозначает бусины размером 1 микрон.

Ответить на этот вопрос непросто. Это будет зависеть от метода обнаружения. При использовании системы обнаружения на основе HRP (пероксидазы хрена) или радиоактивности в сочетании с хорошим антителом требуется очень мало мишени. Больше мишени требуется при использовании системы обнаружения на основе AP (щелочной фосфатазы). При использовании чувствительной системы обнаружения обнаружение, скорее всего, будет в нанограммовом диапазоне. В некоторых случаях можно обнаружить пикограммы мишени.

Хлорид лития включен в промывочный буфер A, чтобы гарантировать, что мРНК остается связанной с Oligo(dT)25 на микросферах, пока все остальное смывается. Основное преимущество использования LiCl вместо других хлоридных солей заключается в том, что LiCl не эффективно осаждает ДНК, белки или углеводы и, следовательно, снижает риск загрязнения конечного препарата мРНК ДНК и ингибиторами синтеза кДНК, ПЦР и т. д.

LiDS — это ионный детергент, аналогичный по функции SDS. LiDS включен в лизирующий буфер, чтобы помочь в лизисе клеток и денатурировать белки, и, кроме того, он является эффективным ингибитором РНКазы. Если у вас нет LiDS в лаборатории, можно также использовать SDS, но вы можете также добавить ингибитор РНКазы.

В практически разумных пределах объем элюции можно увеличивать или уменьшать в зависимости от ваших экспериментальных потребностей. Однако, с объемами менее 10 мкл становится сложнее работать. Кроме того, важно количество целевого белка. Если у вас много частиц с большим количеством связанного целевого белка в небольшом объеме элюции, элюция может быть не очень эффективной. Как правило, 15-100 мкл частиц можно элюировать в 30 мкл. Для эффективного извлечения антигена и/или связывающихся партнеров объем элюции должен как минимум равняться объему частиц.

Существует несколько способов количественного определения количества антител, связанных с бусинами. Самый простой способ – измерить концентрацию антител в реакции связывания до и после присоединения антител. Можно использовать измерения флуоресценции или поглощения при 280 нм. Альтернативно, можно измерить количество антител, связанных с бусинами, с помощью методов флуоресценции, хемилюминесценции или радиоактивной метки.

Как правило, образец тотальной РНК содержит 1-3% мРНК и более 80% рРНК, поэтому загрязнение рРНК весьма вероятно. При выделении мРНК с использованием магнитных шариков Dynabeads загрязнение рРНК может происходить из-за неспецифической адсорбции рРНК на поверхности шариков, а также в результате неспецифической гибридизации рРНК с одноцепочечной мРНК. Однако, по нашему опыту, вторичная структура и четко определенные размеры рРНК могут создать впечатление большего загрязнения рРНК на агарозном геле, чем это есть на самом деле. Вторичная структура рРНК также позволяет большему количеству EtBr интеркалировать, что делает ее более заметной на гелях, чем эквивалентная масса мРНК.

Чтобы уменьшить загрязнение рРНК, мы рекомендуем протокол 'двойной изоляции'. Сначала элюируйте мРНК с шариков в небольшом объеме. Затем промойте шарики в лизирующем/связывающем буфере и ресуспендируйте шарики в лизирующем/связывающем буфере. Те же самые шарики в буфере затем объединяют с элюированной мРНК, и проводится новый цикл отжига и промывки. Важно использовать те же самые шарики, потому что использование новых шариков приведет к некоторой потере мРНК (вероятно, потому что часть РНК свяжется настолько прочно, что не оторвется во время элюции; исходные шарики уже 'покрыты' и больше не будут участвовать в неспецифическом связывании). Большая часть, или вся, рРНК будет удалена второй экстракцией.

Альтернативные/дополнительные способы избавления от загрязнения рРНК включают:
(1) повышение температуры стадии промывки до 37 градусов Цельсия
(2) понижение концентрации соли в промывочном растворе
(3) используйте перчатки и выполняйте этапы на льду
(4) увеличение объема используемого промывочного буфера
(5) увеличение количества этапов промывки

Геномную ДНК и мРНК можно выделить из одного и того же образца, но мы рекомендуем сначала выделить ДНК с помощью набора Dynabeads DNA DIRECT Universal Kit, чтобы избежать связывания крупных фрагментов ДНК с шариками Oligo(dT)25 во время процедуры выделения мРНК.

После выделения геномной ДНК вы можете использовать наборы Dynabeads mRNA DIRECT Kit или Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit для выделения мРНК из того же лизата (просто добавьте магнитные шарики Dynabeads Oligo (dT)25 к лизату, не используйте буферы для лизиса/связывания из набора и следуйте остальной части протокола).

Время инкубации будет зависеть от иммуногенности первичного антитела и его сродства к связыванию с конкретными антигенами. Для хорошего первичного антитела инкубация в течение 30-40 минут должна быть вполне достаточной. Если вы работаете со слабым антителом или белком с очень низкой концентрацией, вы можете попытаться увеличить связывание, инкубируя в течение ночи. Однако это также увеличивает вероятность связывания фоновых белков.

Для очистки мРНК из общей РНК мы разработали набор Dynabeads mRNA Purification Kit (Кат. № 61006). Каждый набор рассчитан на 10 выделений мРНК, начиная с 75 мкг общей РНК, с использованием 200 мкл бусин на выделение.

Возможно масштабирование этих объемов для меньшего исходного количества общей РНК (например, при использовании половины количества общей РНК, используйте половину рекомендованных объемов бусин и буферов). В Thermo Fisher Scientific мы обычно используем тот же протокол и то же количество буферов и бусин при диапазоне общей РНК от 25 до 100 мкг. Даже меньшее количество общей РНК было обработано с использованием того же протокола. Мы рекомендуем соотношение 1:1 между образцом и связывающим буфером для оптимального связывания, и, кроме того, бусины не следует разбавлять больше, чем указано в стандартном протоколе.

Плазмиды должны удаляться при соблюдении протокола выделения мРНК. Однако, если polyA хвост клонирован в плазмиду, он будет гибридизироваться с Oligo(dT)25 beads, что приведет к совместному выделению плазмиды.

Если целевой белок имеет ту же молекулярную массу, что и тяжелая или легкая цепь антитела, мы рекомендуем ковалентно связывать антитело с поверхностью носителя. Это можно сделать либо путем сшивания антитела с магнитными носителями Dynabeads Protein A или G, или с вторичными покрытыми носителями, либо с использованием одного из активированных поверхностью магнитных носителей Dynabeads.

Емкость магнитных частиц Dynabeads Oligo(dT)25 составляет 2 мкг/мг частиц. Количество транскриптов, которые могут связаться, зависит от многих факторов. В смешанной популяции транскриптов связывание будет смещено в сторону более коротких фрагментов. Длинные фрагменты имеют тенденцию мешать участкам связывания с частицами. Длинные полиА-хвосты также могут занимать несколько участков связывания. Если целевой образец состоит из длинных фрагментов, мы рекомендуем использовать избыток магнитных частиц Dynabeads.

Использование магнитных частиц Dynabeads для выделения белков предоставляет несколько преимуществ:

-Быстрая кинетика связывания: поскольку количество частиц Dynabeads на единицу объема примерно в 1000 раз больше, чем для того же объема суспензии сефарозы, вероятность того, что магнитные частицы Dynabeads достигнут цели, намного выше.

-Время инкубации: благодаря быстрой кинетике связывания протокол обычно очень короткий.
-Низкий фон: благодаря быстрой кинетике связывания и короткому времени инкубации фон также очень низкий.
-Улавливание примесей: частицы не имеют внутреннего объема для связывания или улавливания примесей.
-Низкий расход антител: это связано с тем, что магнитные частицы Dynabeads представляют собой непористые, однородные суперпарамагнитные, монодисперсные, высокосшитые полистирольные микросферы, состоящие из равномерного распределения магнитного материала по всей частице. Частицы покрыты тонким слоем высокосшитой полистирольной оболочки, которая заключает в себе магнитный материал и предотвращает любую утечку из частиц или улавливание лигандов внутри частицы. Внешний слой также обеспечивает определенную площадь поверхности для адсорбции или связывания различных молекул, таких как антитела. Однородность размера и формы частиц обеспечивает стабильные физические и химические свойства. Эти однородные физические характеристики приводят к высококачественным, воспроизводимым результатам.
-Воспроизводимость: благодаря более легкому практическому обращению, например, при пипетировании. Не требуются этапы центрифугирования или предварительной очистки.

Да, магнитные гранулы Dynabeads можно использовать для выделения мРНК из растений, но необходимо учитывать некоторые моменты:

Растительные клетки окружены очень прочной клеточной стенкой, что значительно затрудняет достижение полного лизиса клеток. Если вы начинаете с растительного материала, лизис клеток может потребовать больше манипуляций, чем описано в инструкциях к набору Dynabeads mRNA DIRECT Kit. Кроме того, в зависимости от того, из какой части растения будет выделяться мРНК, количество отложенного крахмала также может помешать выделению мРНК. Наконец, вам также необходимо учитывать, какое количество исходного материала вам будет доступно, какова чувствительность последующих методов и хотите ли вы сначала выделить общую РНК (или перейти непосредственно к прямой изоляции мРНК).

Нет. Дитионит является не только восстановителем, но и обладает сильным сродством ионов дитионита к двухвалентным и трехвалентным катионам металлов (M2+, M3+), что позволяет ему повышать растворимость железа, делая его хелатирующим агентом. В результате, железо в магнитных бусинах Dynabeads восстанавливается и извлекается при воздействии дитионита. То же самое наблюдается, если магнитные бусины Dynabeads подвергаются воздействию ДТТ и ЭДТА. Что касается ЭДТА, мы настоятельно рекомендуем проверить минимальное количество ЭДТА, которое ваши конкретные молекулы могут выдержать для связывания с Dynabeads, и повлияет ли это на ваше конкретное применение. Для некоторых применений Dynabeads могут переносить низкие концентрации ЭДТА. С другой стороны, использование 10 мМ ЭДТА с нагреванием влияет на связывание молекул биотина со стрептавидином Dynabeads.

Да, они совместимы с мочевиной в концентрации 6-8 M при использовании на этапах после связывания.

Вот три ссылки на выделение мРНК из небольшого количества клеток с использованием Dynabeads mRNA DIRECT Kit:

Klein CA et al. (2002) Combined transcriptome and genome analysis of single micrometastatic cells. Nat Biotechnol 2(4):387-392.

Zhao J et al. (2001) Effect of activin A on in vitro development of rat preantral follicles and localization of activin A and activin receptor II. Biol Reprod 65(3):967-977.

Karrer EE et al. (1995) In situ isolation of mRNA from individual plant cells: Creation of cell-specific cDNA libraries. Proc Natl Acad Sci 92(9):3814-3818.

Магнитные гранулы Dynabeads Oligo(dT)25 можно использовать повторно. Пожалуйста, ознакомьтесь с инструкциями ниже, как повторно использовать гранулы в зависимости от вашего образца.

Повторное использование: тот же образец
После элюирования мРНК промойте гранулы (исходный объем 200 мкл) один раз в лизирующем/связывающем буфере (300 мкл). Затем добавьте гранулы обратно в ваш образец для дальнейшего выделения мРНК. Изоляцию можно повторять несколько раз, пока вся мРНК не будет захвачена из образца.

Повторное использование: другой образец
Чтобы избежать переноса мРНК между разными образцами, гранулы следует трижды промыть в 200 мкл раствора для восстановления путем стандартной магнитной сепарации. Инкубируйте при 65 градусах C в течение 2 минут во время первой промывки. Затем промойте, используя 200 мкл буфера для хранения Oligo (dT)25, и продолжайте промывки до тех пор, пока pH не станет ниже 8,0. Ресуспендируйте гранулы в желаемом объеме буфера для хранения Oligo (dT)25. Гранулы теперь регенерированы и готовы к выделению мРНК. Храните гранулы при температуре от 2 до 8 градусов C. Не смешивайте регенерированные гранулы с исходной суспензией.

Магнитные гранулы Dynabeads, будучи магнитными по своей природе, на самом деле не предназначены для центрифугирования. Тем не менее, сами гранулы компактны, поскольку поры в полимерной матрице заполнены магнитным материалом и покрыты окончательной внешней полимерной оболочкой, что еще больше повышает жесткость гранул. Следовательно, давление теоретически не должно быть проблемой для самих гранул, но сила, оказываемая гранулами на окружающие клетки в осадке, может быть вредной для клеток.

Мы предлагаем несколько продуктов Dynabeads для выделения мРНК, все из которых основаны на бусинах Dynabeads Oligo dT. Принцип выделения заключается в A:T-спаривании оснований между последовательностью олиго-dT, ковалентно связанной с бусинами, и поли(A)-хвостом эукариотической мРНК.

Магнитные шарики, в отличие от агарозных, являются твердыми и сферическими, и связывание антител ограничено поверхностью каждого шарика. Хотя у магнитных шариков нет преимущества пористого центра для увеличения связывающей способности, они значительно меньше агарозных шариков (1–4 мкм), что в совокупности обеспечивает им адекватное отношение площади поверхности к объему для оптимального связывания антител.

Для локализации магнитных шариков на стенке пробирки и удаления их из поля зрения используются мощные магниты, что позволяет аспирировать лизат клеток без риска аспирации иммунных комплексов, связанных с шариками. Магнитная сепарация позволяет избежать центрифугирования, которое может нарушить слабую связь антитела с антигеном и привести к потере целевого белка.

Однако проблема с использованием магнитных шариков заключается в том, что вариации размера шариков могут препятствовать локализации всех шариков на магните. Кроме того, хотя для иммунопреципитации с использованием агарозных шариков требуется только стандартное лабораторное оборудование, использование магнитных шариков для иммунопреципитации требует мощного магнитного оборудования, которое может быть дорогостоящим.

Это явление можно наблюдать после ОТ-ПЦР, но также и во время этапов промывки при выделении мРНК. кДНК (и олиго-dT на бусинах) заряжена отрицательно и создает заряд на поверхности бусин, что при многократных манипуляциях с магнитом без детергента приводит к электростатическому взаимодействию между бусинами и стенкой пробирки. Наличие соли и/или детергента (LiDS или детергента Tween 20) в буфере часто помогает минимизировать эти электростатические взаимодействия. Мы рекомендуем повторно кондиционировать бусины, добавив до 0,05% детергента Tween 20 (общая концентрация) к образцу на одном этапе промывки и оставив бусины на роллере при комнатной температуре на 5-10 минут. Эта обработка восстановит их нормальный внешний вид, а также их функциональность. Детергент необходимо удалить (две-три промывки без детергента) перед проведением каких-либо ферментативных реакций (например, ОТ-ПЦР). Обратите внимание, что детергент Tween 20 должен быть свободен от РНКаз. Проблема носит в основном косметический характер и не влияет на производительность, но с липкими бусинами может быть сложнее работать.

Магнитные шарики Dynabeads обладают отличными свойствами для автоматизированной обработки жидкостей. Разработаны протоколы для полностью автоматизированного использования магнитных шариков Dynabeads Oligo(dT)25 (например, Biomek 2000 от Beckman Coulter и Genesis RSP от Tecan).

Выделенная мРНК имеет высокую концентрацию и идеально подходит для клонирования и исследований экспрессии. мРНК можно использовать непосредственно в любых последующих применениях в молекулярной биологии, включая Northern-блоттинг, ОТ-ПЦР, вычитающую гибридизацию и создание библиотек кДНК, как это документировано в опубликованной литературе.

Да. Чтобы оценить концентрацию выделенной мРНК, вам необходимо элюировать мРНК с бусин. Полное удаление бусин необходимо, так как Agilent Bioanalyzer не выдает точные показания при наличии каких-либо бусин. Технология твердой фазы Dynabeads облегчает обработку вашего образца, а также элюирование выделенной мРНК путем простого применения магнита. Поэтому рекомендуется применить магнит во второй раз, чтобы удалить любые бусины, оставшиеся в растворе, перед загрузкой чипа РНК и запуском Agilent Bioanalyzer.

Чтобы использовать измерения оптической плотности для определения концентрации мРНК, мРНК сначала нужно будет элюировать с магнитных шариков Dynabeads. Убедитесь, что в растворе не осталось магнитных шариков Dynabeads, так как шарики будут мешать спектрофотометрическим измерениям.

Высококонцентрированную мРНК можно элюировать при температуре от 65 до 80 градусов C (2 минуты) в желаемом объеме, обычно от 10 до 20 мкл или до 5 мкл. Если элюирование происходит в небольшом объеме, следите за тем, чтобы отбирать супернатант, содержащий мРНК, как только шарики переместятся к боковой стенке пробирки, обращенной к магниту. Изменения температуры в таких малых объемах быстро приведут к повторному отжигу мРНК к магнитным шарикам Dynabeads Oligo(dT)25. В качестве буфера для элюирования рекомендуется 10 мМ Tris-HCl, но можно использовать и воду, обработанную DEPC. Однако, если элюированная мРНК должна быть сохранена, настоятельно рекомендуется использовать Tris-HCl.

Перегрузка системы избыточным количеством образца приведет к снижению чистоты выделенной мРНК из-за взаимодействия нуклеиновых кислот. Повторная экстракция мРНК из элюата может устранить совместно выделенную рРНК. Большая часть или вся рРНК будет удалена при второй экстракции.

Общее практическое правило — не перегружать систему избыточным исходным материалом, поскольку количество высвобождаемой ДНК будет влиять на кинетику взаимодействий нуклеиновых кислот. Загрязнение ДНК в очищенном образце мРНК можно удалить, проведя обработку ДНКазой, если это необходимо.

Да, можно хранить лизат в лизирующем/связывающем буфере в течение нескольких месяцев при -20 градусах C. Следует соблюдать осторожность при размораживании образца. Образец следует быстро разморозить, чтобы избежать воздействия РНКаз до растворения LiDS.

Да, буфер на основе GTC (тиоцианат гуанидиния) также может быть использован, но необходим этап разбавления для снижения вязкости лизата.

Набор Dynabeads mRNA Purification Kit поддерживает 10 выделений из 75 мкг общей РНК.
Набор Dynabeads mRNA DIRECT Kit поддерживает 20 (кат. № 61011) или 40 (кат. № 61012) стандартных выделений.
Набор Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit поддерживает 100 выделений из небольших образцов.

Выделение мРНК на основе Dynabeads включает меньше этапов обработки, что сводит к минимуму потери и деградацию образца. Благодаря технологии биомагнитного разделения исключаются центрифугирования и осаждения этанолом. Экстракция фенолом хлороформом больше не требуется. Кроме того, нет необходимости в этапе подготовки тотальной РНК, поскольку мРНК можно выделить непосредственно из исходного образца. Замена буфера и дальнейшая обработка мРНК легко выполняются с помощью магнита.

Выбор продукта/протокола зависит от имеющегося у вас образца:
Dynabeads mRNA Purification Kit предназначен для выделения мРНК из образцов общей РНК. Этот набор содержит связывающий буфер для специфического связывания мРНК с олиго-dT последовательностью на магнитных частицах.
Dynabeads mRNA DIRECT Kit предназначен для прямого выделения мРНК из неочищенных лизатов клеток и тканей животных и растений. Размер образца обычно составляет 2-400 мг ткани или 0,1-20 x 10e6 клеток. Этот набор содержит лизирующий/связывающий буфер для лизиса и специфического связывания мРНК с олиго-dT на магнитных частицах.
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit предназначен для прямого выделения мРНК из очень маленьких образцов тканей и клеток. Принцип аналогичен Dynabeads mRNA DIRECT Kit, но протокол оптимизирован для выделения мРНК из менее чем 2-4 мг ткани или менее чем 150 000 клеток. Этот набор использовался для выделения мРНК даже из одной клетки. (При выделении мРНК из небольших образцов мы рекомендуем проводить ОТ-ПЦР непосредственно на магнитных частицах без элюции).

Выделение мРНК основано на гибридизации полиаденилированной РНК (мРНК) с олиго(dT), ковалентно связанным с магнитными частицами Dynabeads. Связывающий буфер и буфер для лизиса/связывания в наборах для выделения мРНК оптимизированы для этой гибридизации.

Выход мРНК обычно составляет от 1 до 3% от общей РНК. Например, если вы начинаете со 100 мкг общей РНК, вы должны ожидать выход от 1 до 3 мкг мРНК.

1% в лизирующем буфере.

У нас нет конкретного минимального номера клетки для набора Dynabeads mRNA DIRECT Purification Kit. Если у вас небольшая популяция (менее 150 тысяч клеток), мы рекомендуем следовать рекомендациям по объему для микро-версии протокола в руководстве пользователя Dynabeads mRNA DIRECT Kit. Содержание РНК и, в частности, мРНК может варьироваться между типами клеток, поэтому вам необходимо будет определить оптимальное количество клеток для использования этого набора. Предполагается, что популяция мРНК составляет 1-5% от общего количества РНК, выделенной из клеток, поэтому вы можете определить необходимое количество клеток для вашей работы, используя таблицу, приведенную на стр. 2 руководства пользователя, в качестве справочной информации.