Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder: маркер молекулярной массы белков

Верхние полосы лестницы могут быть деградированы протеазами. Лестница, гель, буфер, пипетки, наконечники для пипеток или оборудование могут быть загрязнены протеазами во время использования. Общая рекомендация - избегать работы с протеазами в одном помещении. Мы рекомендуем готовить свежие растворы, очищать оборудование и использовать чистые пипетки и наконечники. Если сама лестница загрязнена, пожалуйста, используйте новую пробирку с лестницей.

Присоединение хромофоров к белкам влияет на кажущуюся молекулярную массу белков в SDS-PAGE по сравнению с неокрашенными стандартами. Кажущаяся молекулярная масса предварительно окрашенных белковых стандартов откалибрована в классической системе TRIS-глицин-SDS Laemmli, однако предварительно окрашенные белки могут иметь разную подвижность в других буферах для электрофореза и гелевых системах. Следует также отметить, что определение размера белков с помощью гель-электрофореза не дает точного значения и зависит от последовательности белка и пост-модификаций.

- Уменьшите напряжение, ток или время переноса.
- Убедитесь, что концентрация метанола в трансферном буфере правильная; используйте концентрацию метанола 10-20% для удаления SDS из SDS-белковых комплексов, это улучшает связывание белка с мембраной.
- Убедитесь, что концентрация SDS (если он добавлен) в трансферном буфере правильная, не используйте более 0,02-0,04% SDS. Использование слишком большого количества SDS может препятствовать связыванию белков с мембраной.
- Проверьте размер пор мембраны и размер целевого белка. Белки размером менее 10 кДа легко проходят через мембрану с размером пор 0,45 мкм. Если вас интересуют белки размером менее 10 кДа, лучше использовать мембрану с размером пор 0,2 мкм.

Ответ: Нет, белки в белковых лестницах Thermo Scientific не содержат His-Tag. Однако, неспецифическое взаимодействие между белками лестницы и первичными или вторичными антителами возможно, и некоторые системы обнаружения His-Tag, такие как Thermo Scientific 6xHis Protein Tag Stain Reagent Kit, демонстрируют неспецифическое взаимодействие. Полосы белковой лестницы легче обнаруживаются при использовании высоких концентраций антител. Неспецифическая перекрестная реактивность трудно предсказуема, она часто имеет различный паттерн в зависимости от антител, используемых в каждом отдельном эксперименте. Наиболее общим способом решения этой проблемы было бы использование более низких концентраций антител и меньшего количества белковых лестниц. Также может быть полезно оставить одну пустую лунку между лестницей и образцом, чтобы избежать возможной утечки сигнала в соседнюю дорожку с образцом.

- Увеличьте напряжение, ток или время переноса.
- SDS в геле и в SDS-белковых комплексах способствует элюированию белка из гелей, но ингибирует связывание белка с мембранами. Это ингибирование сильнее для нитроцеллюлозы, чем для PVDF. Для белков, которые трудно элюировать из геля, таких как белки с большой молекулярной массой, небольшое количество SDS можно добавить в трансферный буфер для улучшения переноса. Мы рекомендуем предварительно уравновесить гель в 2X трансферном буфере (без метанола), содержащем 0,02-0,04% SDS, в течение 10 минут перед сборкой сэндвича, а затем переносить, используя 1X трансферный буфер, содержащий 10% метанола и 0,01% SDS.
- Метанол удаляет SDS из SDS-белковых комплексов и улучшает связывание белка с мембраной, но оказывает некоторое негативное воздействие на сам гель, что приводит к снижению эффективности переноса. Он может привести к уменьшению размера пор, осаждению некоторых белков и к тому, что некоторые основные белки становятся положительно заряженными или нейтральными. Убедитесь, что концентрация метанола в трансферном буфере не превышает 10-20%, и что используется высококачественный метанол аналитического класса.

Белковые лестницы PageRuler Unstained можно обнаружить непосредственно на вестерн-блотах с помощью конъюгатов Strep-Tactin или антитела к последовательности Strep-tag II. Все белки лестниц PageRuler и Spectra содержат встроенную последовательность Strep-tag II, однако предварительно окрашенные лестницы не могут быть обнаружены конъюгатами Strep-Tactin.

Предварительно окрашенные стандарты имеют краситель, ковалентно связанный с каждым белком, что приводит к различной миграции стандарта в разных буферных системах (т.е., разных гелях). В результате, использование предварительно окрашенного стандарта для оценки молекулярной массы даст только кажущуюся молекулярную массу белка. Предварительно окрашенные стандарты можно использовать для приблизительной оценки молекулярной массы, подтверждения миграции геля и оценки эффективности блоттинга, но для точной оценки молекулярной массы следует использовать неокрашенный стандарт.

Find additional tips, troubleshooting help, and resources within our Protein Assays and Analysis Support Center.

Все полосы лесенки PageRuler и Spectra представляют собой рекомбинантные прокариотические белки, очищенные из клеток E. coli. Ни один из них не связан с эукариотическими белками, однако это не исключает возможности того, что белки лесенки могут обладать эпитопом, который имеет перекрестную реактивность с используемым антителом.

Полосы белкового маркера (ladder) иногда могут быть обнаружены при использовании хемилюминесцентных методов из-за неспецифического взаимодействия белков маркера с первичными или вторичными антителами (или с обоими). Полосы маркера редко обнаруживаются хромогенными субстратами. Чрезвычайно высокая чувствительность хемилюминесцентных анализов необходима для визуализации полос, поэтому фактическая степень перекрестной реактивности низкая. Неспецифическую перекрестную реактивность трудно предсказать, и она часто имеет разный характер в зависимости от используемых антител. Если антитела распознают линейный эпитоп, перекрестная реактивность может быть связана с гомологией последовательностей. Если антитела реагируют с устойчивым к денатурации конформационным эпитопом, может быть невозможно определить точную причину обнаруженной перекрестной реактивности. Самый общий способ решения этой проблемы - использовать более низкие концентрации антител.

- При загрузке следите за тем, чтобы не было перекрестного загрязнения из соседних дорожек с образцами.
- Убедитесь, что на дорожку загружено правильное количество стандарта. Загрузка слишком большого количества белка может привести к появлению дополнительных полос, и это особенно актуально для гелей, окрашенных серебром.
- Неправильное хранение стандарта или повторное замораживание/оттаивание может привести к деградации белка.

Ослабление, скорее всего, вызвано детергентом в растворах для блокировки/промывки вестерн-блоттинга, который может удалять часть белков с мембраны. Сам краситель не смоется с белков, поскольку он связан ковалентно. Мы обнаружили, что мембраны с меньшим размером пор лучше удерживают белки во время блокировки и промывки, и поэтому рекомендуем использовать мембраны с порами 0,2 мкм вместо 0,45 мкм для наилучшего разрешения и удержания белка. После переноса рекомендуется обвести предварительно окрашенные полосы карандашом на мембране, чтобы можно было идентифицировать положение полос после блокировки и обработки.

Нет. Белковые маркеры Thermo Scientific содержат смесь рекомбинантных прокариотических белков, очищенных из клеток *E. coli*. У *E. coli* нет собственных путей гликозилирования, поэтому ни один из белков маркера не гликозилирован.

Вот несколько советов:

- Убедитесь, что на дорожку загружено правильное количество стандарта. Загрузка слишком большого количества белка может вызвать размытие, и это особенно проблематично при окрашивании гелей серебром.
- Полосы не будут так хорошо разделены в гелях с низким процентом. Попробуйте использовать гель с более высоким процентом.
- Если полосы выглядят размытыми и нечеткими после вестерн-блоттинга/детекции, это может быть связано со слишком высокой концентрацией антитела. Следуйте рекомендованному производителем разведению или определите оптимальную концентрацию антитела с помощью дот-блоттинга.

Лестницы Thermo Scientific не предназначены для количественного определения белков. Для количественного определения мы рекомендуем использовать белок известной концентрации в качестве эталона.

Вот несколько предложений:

- Проверьте тип/процент геля, который был использован. В зависимости от типа геля и/или процентного содержания, все полосы могут быть не видны. Например, самые маленькие полосы белкового стандарта могут не разрешиться на геле с очень низким процентом, тогда как полосы с более высокой молекулярной массой могут не разрешиться на геле с высоким процентом.
- Проверьте срок годности белкового стандарта. Истекшие партии могут привести к исчезновению или отсутствию полос из-за деградации белка.
- Проверьте условия хранения белкового стандарта. Неправильные условия хранения поставят под угрозу стабильность белков в стандарте.
- Убедитесь, что белковый стандарт не нагревался/не кипятился перед нанесением на гель. Наши белковые стандарты готовы к загрузке, и мы не рекомендуем нагревать/кипятить их, так как это может привести к деградации белков в стандарте.

Ответ: Да, PageRuler Prestained NIR Protein Ladder (Cat. No. 26635) содержит белки, окрашенные в синий цвет и помеченные флуоресцентной меткой для визуализации в ближнем ИК-диапазоне и определения размера белков после электрофореза.

Белковые маркеры можно запускать на гелях с более низким процентом, чем мы рекомендуем, однако следует ожидать, что несколько полос белков с низкой молекулярной массой вытекут из геля, если гель запускается до тех пор, пока фронт красителя не достигнет дна геля. В случае более короткого времени электрофореза также возможно, что некоторые нижние полосы не разделятся и будут скрыты фронтом красителя. Кроме того, полосы белков с низкой молекулярной массой могут выглядеть размытыми. Гели с более низким процентом можно использовать в случаях, когда заказчик заинтересован только в визуализации крупных белков.

Большинство распространенных гель-электрофорезных буферов состоят из Трис-глицина или Трис-трицина. Трис-глициновые буферные системы полезны для разделения белков в широком диапазоне молекулярных масс (5-300 кДа) и совместимы с денатурирующими или неденатурирующими условиями. Трис-трициновый буфер обычно рекомендуется для электрофореза белков и пептидов с низкой молекулярной массой (<10 кДа), которые необходимо восстановить и денатурировать перед загрузкой. Трис-ацетатная буферная система используется для разделения более крупных белков (>200 кДа).

Зимограммные гели, по сути, являются Трис-глициновыми гелями, содержащими субстрат. Белковые стандарты перемещаются, основываясь исключительно на процентном содержании акриламида, и поэтому должны перемещаться одинаково в обоих типах гелей. Вполне возможно, однако, что если стандарт предварительно окрашен, белки будут казаться другого цвета из-за окрашивания (или предварительного окрашивания) зимограммных гелей.

Предварительно окрашенные маркеры/лестницы рекомендуются для приблизительного определения молекулярной массы и для мониторинга хода электрофореза и эффективности переноса белка на мембраны во время процедур вестерн-блоттинга. Неокрашенные маркеры/лестницы используются для точного определения молекулярных масс в любой денатурирующей буферной системе.

Наши протеиновые стандарты не предназначены для количественного определения белка.

Мы не предоставляем точную или приблизительную концентрацию белков в белковых лестницах Thermo Scientific, и они не предназначены для использования при количественном определении концентрации белка в полосе. Для денситометрической оценки мы рекомендуем загружать известное количество белкового стандарта и определять линейный диапазон в соответствии с используемым гелем или мембранным красителем.

Пожалуйста, найдите эту информацию в соответствующих руководствах для отдельных белковых стандартов.

Наши белковые стандарты готовы к нанесению. Мы не рекомендуем нагревать их, так как это может привести к деградации белка.

Вот возможные причины и решения:

- Недостаточный объем маркера, загруженного на гель: Загрузите соответствующий объем маркера на гель. Вот наши рекомендации:
--- Мини-гель: 5 мкл на лунку (толщина 0,75-1,0 мм) или 10 мкл на лунку (толщина 1,5 мм)
--- Большой гель: 10 мкл на лунку (толщина 0,75-1,0 мм) или 20 мкл на лунку (толщина 1,5 мм)
- Неполный или плохой перенос: Оптимизируйте условия переноса

За исключением нашего NativeMark Unstained Protein Standard (предназначенного для нативного электрофореза), все остальные неокрашенные и предварительно окрашенные стандарты, которые мы предлагаем (Invitrogen Sharp, SeeBlue, SeeBlue Plus2, BenchMark, HiMark), уже были предварительно восстановлены (запатентованным методом). Следовательно, вам не нужно добавлять восстановитель.

Вот возможные причины и решения:

Вот возможные причины и решения:

- Маркер был прокипячен: Выбросьте прокипяченную аликвоту.
- Использовался слишком большой объем маркера: Добавьте меньший объем или разбавьте маркер в буфере для загрузки белка перед использованием.

Мы не рекомендуем использовать наши предварительно окрашенные стандарты для нативного гель-электрофореза, поскольку они уже денатурированы (в буфере для образцов SDS) и предварительно восстановлены (запатентованным методом) и не будут хорошо разделяться в нативных условиях.

Мы рекомендуем использовать неокрашенные белковые маркеры для оценки молекулярной массы, поскольку предварительно окрашенные маркеры содержат краситель, ковалентно связанный с каждым белком, что приведет к различной миграции маркера в разных буферных системах (т.е. в разных гелях). В результате, использование предварительно окрашенного маркера для оценки молекулярной массы даст только кажущуюся молекулярную массу белка. Предварительно окрашенные маркеры можно использовать для приблизительной оценки молекулярной массы, подтверждения миграции в геле и оценки эффективности блоттинга, но для точной оценки молекулярной массы следует использовать неокрашенный маркер.

Белковые стандарты Spectra содержат рекомбинантные прокариотические белки и не содержат белков животного происхождения.

Белковый маркер Spectra Multicolor Broad Range — это смесь из 10 рекомбинантных предварительно окрашенных белков в диапазоне от 10 кДа до 260 кДа, предназначенных для использования в гель-электрофорезе и вестерн-блоттинге. Четыре различных хромофора связаны с белками, образуя ярко окрашенный маркер.

Мы рекомендуем хранить белковые лестницы Spectra при -20 градусах C, где они стабильны в течение года. Белковая лестница Spectra Multicolor Broad Range и белковая лестница Spectra Multicolor High Range стабильны до 3 месяцев при 4 градусах C. Белковая лестница Spectra Multicolor Low Range стабильна до 2 месяцев при 4 градусах C.