PeppermintStick™ Phosphoprotein Molecular Weight Standards, 400 мкл

- Уменьшите напряжение, ток или время переноса.
- Убедитесь, что концентрация метанола в трансферном буфере правильная; используйте концентрацию метанола 10-20% для удаления SDS из SDS-белковых комплексов, это улучшает связывание белка с мембраной.
- Убедитесь, что концентрация SDS (если он добавлен) в трансферном буфере правильная, не используйте более 0,02-0,04% SDS. Использование слишком большого количества SDS может препятствовать связыванию белков с мембраной.
- Проверьте размер пор мембраны и размер целевого белка. Белки размером менее 10 кДа легко проходят через мембрану с размером пор 0,45 мкм. Если вас интересуют белки размером менее 10 кДа, лучше использовать мембрану с размером пор 0,2 мкм.

- Увеличьте напряжение, ток или время переноса.
- SDS в геле и в SDS-белковых комплексах способствует элюированию белка из гелей, но ингибирует связывание белка с мембранами. Это ингибирование сильнее для нитроцеллюлозы, чем для PVDF. Для белков, которые трудно элюировать из геля, таких как белки с большой молекулярной массой, небольшое количество SDS можно добавить в трансферный буфер для улучшения переноса. Мы рекомендуем предварительно уравновесить гель в 2X трансферном буфере (без метанола), содержащем 0,02-0,04% SDS, в течение 10 минут перед сборкой сэндвича, а затем переносить, используя 1X трансферный буфер, содержащий 10% метанола и 0,01% SDS.
- Метанол удаляет SDS из SDS-белковых комплексов и улучшает связывание белка с мембраной, но оказывает некоторое негативное воздействие на сам гель, что приводит к снижению эффективности переноса. Он может привести к уменьшению размера пор, осаждению некоторых белков и к тому, что некоторые основные белки становятся положительно заряженными или нейтральными. Убедитесь, что концентрация метанола в трансферном буфере не превышает 10-20%, и что используется высококачественный метанол аналитического класса.

Предварительно окрашенные стандарты имеют краситель, ковалентно связанный с каждым белком, что приводит к различной миграции стандарта в разных буферных системах (т.е., разных гелях). В результате, использование предварительно окрашенного стандарта для оценки молекулярной массы даст только кажущуюся молекулярную массу белка. Предварительно окрашенные стандарты можно использовать для приблизительной оценки молекулярной массы, подтверждения миграции геля и оценки эффективности блоттинга, но для точной оценки молекулярной массы следует использовать неокрашенный стандарт.

Find additional tips, troubleshooting help, and resources within our Protein Assays and Analysis Support Center.

- При загрузке следите за тем, чтобы не было перекрестного загрязнения из соседних дорожек с образцами.
- Убедитесь, что на дорожку загружено правильное количество стандарта. Загрузка слишком большого количества белка может привести к появлению дополнительных полос, и это особенно актуально для гелей, окрашенных серебром.
- Неправильное хранение стандарта или повторное замораживание/оттаивание может привести к деградации белка.

Вот несколько советов:

- Убедитесь, что на дорожку загружено правильное количество стандарта. Загрузка слишком большого количества белка может вызвать размытие, и это особенно проблематично при окрашивании гелей серебром.
- Полосы не будут так хорошо разделены в гелях с низким процентом. Попробуйте использовать гель с более высоким процентом.
- Если полосы выглядят размытыми и нечеткими после вестерн-блоттинга/детекции, это может быть связано со слишком высокой концентрацией антитела. Следуйте рекомендованному производителем разведению или определите оптимальную концентрацию антитела с помощью дот-блоттинга.

Все белки представляют собой одноцепочечные мономерные белки (без субъединиц). Фосфопротеины являются серин-фосфатами. Овальбумин имеет 2 фосфорилированных остатка, а β-казеин - 5 фосфорилированных остатков. Мы не определяем, присутствуют ли все фосфаты во все времена для каждой партии, и можем только предполагать, что большинство каждого белка имеет все сайты фосфорилированы. Любой белок, извлеченный из природного источника, всегда может иметь потенциал для некоторой дефосфорилирования во время экстракции/очистки или естественной клеточной активностью. Для более точного сравнения количества фосфорилирований с интенсивностью окрашивания необходимо использовать синтезированный пептид с известным количеством фосфатов. Подробности смотрите ниже:

- β-галактозидаза: 116 250 кДа; Нет фосфопротеина; Нет гликопротеина; Источник - E. coli
- Бычий сывороточный альбумин: 66 200 кДа; Нет фосфопротеина; Нет гликопротеина; Источник - Бычья сыворотка
- Овальбумин: 45 000 кДа; Фосфопротеин присутствует; Гликопротеин присутствует; Источник - Куриное яйцо
- β-казеин: 23 600 кДа; Фосфопротеин присутствует; Нет гликопротеина; Источник - Коровье молоко
- Авидин: 18 000 кДа; Нет фосфопротеина; Гликопротеин присутствует; Источник - Куриное яйцо
- Лизоцим: 14 400 кДа; Нет фосфопротеина; Нет гликопротеина; Источник - Куриное яйцо

Вот несколько предложений:

- Проверьте тип/процент геля, который был использован. В зависимости от типа геля и/или процентного содержания, все полосы могут быть не видны. Например, самые маленькие полосы белкового стандарта могут не разрешиться на геле с очень низким процентом, тогда как полосы с более высокой молекулярной массой могут не разрешиться на геле с высоким процентом.
- Проверьте срок годности белкового стандарта. Истекшие партии могут привести к исчезновению или отсутствию полос из-за деградации белка.
- Проверьте условия хранения белкового стандарта. Неправильные условия хранения поставят под угрозу стабильность белков в стандарте.
- Убедитесь, что белковый стандарт не нагревался/не кипятился перед нанесением на гель. Наши белковые стандарты готовы к загрузке, и мы не рекомендуем нагревать/кипятить их, так как это может привести к деградации белков в стандарте.

Для длительного хранения храните пробирку с основным раствором при температуре -20°C или -80°C. Для кратковременного хранения храните при температуре 2-6°C. Основной раствор можно подвергать повторному замораживанию и оттаиванию без каких-либо отрицательных последствий для молекулярной массы белков или их миграции во время электрофореза.

Каждый из шести белков присутствует в концентрации примерно 0,5 мкг/мкл.

Зимограммные гели, по сути, являются Трис-глициновыми гелями, содержащими субстрат. Белковые стандарты перемещаются, основываясь исключительно на процентном содержании акриламида, и поэтому должны перемещаться одинаково в обоих типах гелей. Вполне возможно, однако, что если стандарт предварительно окрашен, белки будут казаться другого цвета из-за окрашивания (или предварительного окрашивания) зимограммных гелей.

Наши протеиновые стандарты не предназначены для количественного определения белка.

Пожалуйста, найдите эту информацию в соответствующих руководствах для отдельных белковых стандартов.

Наши белковые стандарты готовы к нанесению. Мы не рекомендуем нагревать их, так как это может привести к деградации белка.

За исключением нашего NativeMark Unstained Protein Standard (предназначенного для нативного электрофореза), все остальные неокрашенные и предварительно окрашенные стандарты, которые мы предлагаем (Invitrogen Sharp, SeeBlue, SeeBlue Plus2, BenchMark, HiMark), уже были предварительно восстановлены (запатентованным методом). Следовательно, вам не нужно добавлять восстановитель.