Набор для синтеза первой цепи кДНК Maxima для RT-qPCR с dsDNase, 50 реакций

dsDNase можно инактивировать, инкубируя образец при 55°C в течение 5 минут в присутствии 10 мМ ДТТ.

Следовые количества реагентов, используемых в протоколах очистки РНК, могут оставаться в растворе и ингибировать синтез первой цепи, например, SDS, EDTA, соли гуанидина, фосфат, пирофосфат, полиамины, спермидин. Для удаления следовых загрязнений мы рекомендуем повторно осадить РНК этанолом и промыть осадок 75% этанолом, или повторно очистить РНК.

В целом, полезно минимизировать активность РНКазы H, когда вы стремитесь получить длинные транскрипты для клонирования кДНК. РНКаза H деградирует РНК из РНК-ДНК дуплексов, что может привести к укороченной кДНК во время обратной транскрипции длинной мРНК. Также рекомендуется использовать RTs без активности РНКазы H для независимого от матрицы добавления C нуклеотидов. В отличие от этого, обратные транскриптазы с собственной активностью РНКазы H часто предпочтительны в приложениях qPCR.

Чистота и целостность РНК необходимы для синтеза и количественного определения кДНК. Всегда оценивайте целостность РНК перед синтезом кДНК. Используйте свежеприготовленную РНК. Многократные циклы замораживания/оттаивания образца РНК и синтезированной кДНК не рекомендуются. Избегайте загрязнения РНКазой и утилизируйте РНК низкого качества.

Все обратные транскриптазы Thermo Scientific обладают собственной TdT-активностью, хотя и в разной степени в зависимости от условий реакции. Для добавления C-нуклеотидов, не зависящих от матрицы (как для экспериментов SMART и RACE), эта специфическая TdT-активность может быть индуцирована Mn2+. Мы рекомендуем Maxima H- или RevertAid H- minus RT для этой цели.

Синтез кДНК при более высоких температурах обеспечивает успешную транскрипцию РНК с высоким уровнем вторичной структуры, уменьшая проблемы доступа праймера к матрице. Поэтому мы рекомендуем использовать ферменты ОТ с высокой термостабильностью, например, обратные транскриптазы Maxima и Maxima H Minus, которые обеспечивают более высокий выход полноразмерной кДНК, лучшую чувствительность и успешную транскрипцию GC-богатых матриц.

Как правило, выгодно минимизировать активность РНКазы H при стремлении получить длинные транскрипты для клонирования кДНК. РНКаза H разрушает РНК из РНК-ДНК дуплексов, что может привести к укороченной кДНК во время обратной транскрипции длинной мРНК. Также рекомендуется использовать обратные транскриптазы без РНКазы H для не зависимого от матрицы добавления нуклеотидов C. В отличие от этого, обратные транскриптазы с собственной активностью РНКазы H часто предпочитают в приложениях qPCR.

Точность обратных транскриптаз RevertAid и Maxima такая же, как и у дикого типа M-MuLV RT, и составляет примерно 1 ошибку на 15 000-27 000 синтезированных нуклеотидов.

Нет, dsDNase расщепляет только двухцепочечную ДНК. Однако, если ssDNA образует двухцепочечные структуры, она будет являться мишенью для dsDNase. Из-за этого длинная и сложная ssDNA может быть частично деградирована. Поэтому мы рекомендуем дополнительный этап инактивации dsDNase для RT-PCR амплификации мишеней длиной 3 kb или более. Этап инактивации следует проводить путем инкубации в течение 5 минут при 55 градусах C в присутствии 10 мМ DTT.

Нет. Состав реакционной смеси для обратной транскрипции ингибирует активность dsDNase, и удаление геномной ДНК может быть неполным.

Все обратные транскриптазы Thermo Scientific (RevertAid RT, RevertAid H Minus RT, Maxima RT и Maxima H Minus RT) обладают внутренней TdT активностью, хотя и в разной степени, в зависимости от условий реакции. Для добавления шаблон-независимых C-нуклеотидов (как в экспериментах SMART и RACE), эта специфическая TdT активность может быть индуцирована Mn2+. Для этой цели мы рекомендуем использовать Maxima H Minus RT или RevertAid H Minus RT.

Да. Буфер dsDNase не требуется для последующей реакции обратной транскрипции. Если образец РНК не загрязнен геномной ДНК, обработку dsDNase можно пропустить.

Основное различие между этими двумя ферментами заключается в том, что dsDNase термолабильна (легко инактивируется умеренной тепловой обработкой (55 градусов C)) и, следовательно, не требует отдельной стадии тепловой инактивации. Она инактивируется во время самой реакции обратной транскрипции (синтеза кДНК). Turbo DNase, с другой стороны, не является термолабильной и, следовательно, требует тепловой инактивации после переваривания или должна быть удалена экстракцией фенолом-хлороформом.