MagicMark XP Western Protein Standard: Маркер молекулярной массы белков

Контрольный белок Positope (Кат. № R90050) предназначен для использования в качестве положительного контроля при вестерн-блоттинге для различных антител. Контрольный белок представляет собой высокоочищенный рекомбинантный белок с молекулярной массой 53 кДа, содержащий семь эпитопных меток, включая Xpress, c-myc, V5, His(C-term), HisG(N-term), тиоредоксин и GFP.

Стандарт белков MagicMark XP Western Protein (Кат. № LC5602) состоит из пептидов, содержащих домен связывания IgG. Эти пептиды можно обнаружить с помощью ваших обычных антител, что позволяет получить хорошие оценки молекулярной массы без необходимости полагаться на перенесенные предварительно окрашенные стандарты.

Вот несколько предложений:

- Убедитесь, что реагенты для детекции работают хорошо. Оптимизируйте концентрацию антител для получения наилучших результатов.
- Убедитесь, что количество стандарта, загруженного на гель, правильное.
- Оптимизируйте условия переноса (ток, напряжение, время переноса).
- Первичные антитела, конъюгированные с ферментами, могут неэффективно связываться с белками в MagicMark XP Western Protein Standard. Мы рекомендуем использовать неконъюгированные первичные антитела с последующим добавлением вторичных антител, конъюгированных с ферментами.
Примечание: Антитела Anti-myc-AP/HRP и Anti-V5-AP/HRP не связываются с белками MagicMark XP.

Стандарты MagicMark XP состоят из смеси восьми рекомбинантных белков, экспрессированных в E. coli, с размерами от 20 до 120 кДа. Каждый белок содержит IgG-связывающую последовательность из белка G. Этот сайт связывания IgG связывает первичное или вторичное антитело, используемое для обнаружения целевого белка, что позволяет обнаруживать стандарт MagicMark напрямую.

- Уменьшите напряжение, ток или время переноса.
- Убедитесь, что концентрация метанола в трансферном буфере правильная; используйте концентрацию метанола 10-20% для удаления SDS из SDS-белковых комплексов, это улучшает связывание белка с мембраной.
- Убедитесь, что концентрация SDS (если он добавлен) в трансферном буфере правильная, не используйте более 0,02-0,04% SDS. Использование слишком большого количества SDS может препятствовать связыванию белков с мембраной.
- Проверьте размер пор мембраны и размер целевого белка. Белки размером менее 10 кДа легко проходят через мембрану с размером пор 0,45 мкм. Если вас интересуют белки размером менее 10 кДа, лучше использовать мембрану с размером пор 0,2 мкм.

- Увеличьте напряжение, ток или время переноса.
- SDS в геле и в SDS-белковых комплексах способствует элюированию белка из гелей, но ингибирует связывание белка с мембранами. Это ингибирование сильнее для нитроцеллюлозы, чем для PVDF. Для белков, которые трудно элюировать из геля, таких как белки с большой молекулярной массой, небольшое количество SDS можно добавить в трансферный буфер для улучшения переноса. Мы рекомендуем предварительно уравновесить гель в 2X трансферном буфере (без метанола), содержащем 0,02-0,04% SDS, в течение 10 минут перед сборкой сэндвича, а затем переносить, используя 1X трансферный буфер, содержащий 10% метанола и 0,01% SDS.
- Метанол удаляет SDS из SDS-белковых комплексов и улучшает связывание белка с мембраной, но оказывает некоторое негативное воздействие на сам гель, что приводит к снижению эффективности переноса. Он может привести к уменьшению размера пор, осаждению некоторых белков и к тому, что некоторые основные белки становятся положительно заряженными или нейтральными. Убедитесь, что концентрация метанола в трансферном буфере не превышает 10-20%, и что используется высококачественный метанол аналитического класса.

Предварительно окрашенные стандарты имеют краситель, ковалентно связанный с каждым белком, что приводит к различной миграции стандарта в разных буферных системах (т.е., разных гелях). В результате, использование предварительно окрашенного стандарта для оценки молекулярной массы даст только кажущуюся молекулярную массу белка. Предварительно окрашенные стандарты можно использовать для приблизительной оценки молекулярной массы, подтверждения миграции геля и оценки эффективности блоттинга, но для точной оценки молекулярной массы следует использовать неокрашенный стандарт.

Find additional tips, troubleshooting help, and resources within our Protein Assays and Analysis Support Center.

- При загрузке следите за тем, чтобы не было перекрестного загрязнения из соседних дорожек с образцами.
- Убедитесь, что на дорожку загружено правильное количество стандарта. Загрузка слишком большого количества белка может привести к появлению дополнительных полос, и это особенно актуально для гелей, окрашенных серебром.
- Неправильное хранение стандарта или повторное замораживание/оттаивание может привести к деградации белка.

Вот несколько советов:

- Убедитесь, что на дорожку загружено правильное количество стандарта. Загрузка слишком большого количества белка может вызвать размытие, и это особенно проблематично при окрашивании гелей серебром.
- Полосы не будут так хорошо разделены в гелях с низким процентом. Попробуйте использовать гель с более высоким процентом.
- Если полосы выглядят размытыми и нечеткими после вестерн-блоттинга/детекции, это может быть связано со слишком высокой концентрацией антитела. Следуйте рекомендованному производителем разведению или определите оптимальную концентрацию антитела с помощью дот-блоттинга.

Вот несколько предложений:

- Проверьте тип/процент геля, который был использован. В зависимости от типа геля и/или процентного содержания, все полосы могут быть не видны. Например, самые маленькие полосы белкового стандарта могут не разрешиться на геле с очень низким процентом, тогда как полосы с более высокой молекулярной массой могут не разрешиться на геле с высоким процентом.
- Проверьте срок годности белкового стандарта. Истекшие партии могут привести к исчезновению или отсутствию полос из-за деградации белка.
- Проверьте условия хранения белкового стандарта. Неправильные условия хранения поставят под угрозу стабильность белков в стандарте.
- Убедитесь, что белковый стандарт не нагревался/не кипятился перед нанесением на гель. Наши белковые стандарты готовы к загрузке, и мы не рекомендуем нагревать/кипятить их, так как это может привести к деградации белков в стандарте.

Точное количество белка в каждой полосе стандарта является конфиденциальной информацией. Мы не рекомендуем использовать этот стандарт для количественного определения.

Первичные антитела, конъюгированные с ферментом, могут неэффективно связываться с белками в белковом стандарте MagicMark XP Western. Мы рекомендуем использовать неконъюгированные первичные антитела с последующим добавлением вторичных антител, конъюгированных с ферментом.+
Примечание: Антитела Anti-myc-AP/HRP и Anti-V5-AP/HRP не связываются с белками MagicMark XP.

Вот относительная аффинность белкового стандарта MagicMark XP Western к IgG антителам разных видов:

Человек, Лошадь, Корова: ++++
Свинья, Кролик: +++
Коза, Овца, Хомяк, Морская свинка, Крыса, Мышь: ++Курица: +

Зимограммные гели, по сути, являются Трис-глициновыми гелями, содержащими субстрат. Белковые стандарты перемещаются, основываясь исключительно на процентном содержании акриламида, и поэтому должны перемещаться одинаково в обоих типах гелей. Вполне возможно, однако, что если стандарт предварительно окрашен, белки будут казаться другого цвета из-за окрашивания (или предварительного окрашивания) зимограммных гелей.

Вы можете объединить 5 мкл MagicMark XP Standard с 5 мкл Invitrogen Sharp Prestained Standard или 10 мкл MagicMark XP Standard с 5 мкл SeeBlue Prestained Standard в одном запуске, используя одну и ту же лунку. Цветные полосы от окрашенного стандарта можно использовать для подтверждения запуска геля и переноса. После иммунодетекции четкие полосы MagicMark XP проявятся непосредственно на вестерн-блоте.

Каждый белок в MagicMark XP Western Protein Standard содержит сайт связывания IgG, что позволяет проводить прямую визуализацию с использованием тех же реагентов антитело-конъюгатов, которые используются для обнаружения целевого белка. Белки в стандарте не будут связываться с IgM антителами.

Наши протеиновые стандарты не предназначены для количественного определения белка.

Полосы белка MagicMark XP можно визуализировать с помощью тех же реагентов конъюгата антител, которые используются для обнаружения целевого белка, используя либо колориметрические, либо хемилюминесцентные методы. Стандарт MagicMark XP можно использовать для оценки молекулярного веса белков. Каждый белок в белковом стандарте MagicMark XP Western содержит сайт связывания IgG. Белки в стандарте не будут связываться с антителами IgM.

Пожалуйста, найдите эту информацию в соответствующих руководствах для отдельных белковых стандартов.

Наши белковые стандарты готовы к нанесению. Мы не рекомендуем нагревать их, так как это может привести к деградации белка.

Стандарт MagicMark XP Western Protein Standard предназначен для оценки молекулярной массы белков непосредственно на вестерн-блотах. Каждый белок в стандарте содержит сайт связывания IgG, что позволяет напрямую визуализировать его с помощью тех же реагентов с конъюгированными антителами, которые используются для обнаружения целевого белка на блотах. Для анализа можно использовать колориметрические, хемилюминесцентные или флуоресцентные методы обнаружения. Стандарт MagicMark XP Western Protein Standard совместим с гелями NuPAGE и Tris-Glycine. Вот молекулярные массы белков в стандарте MagicMark XP Western Protein Standard:

- Полоса 1: 220 кДа
- Полоса 2: 120 кДа
- Полоса 3: 100 кДа
- Полоса 4: 80 кДа
- Полоса 5: 60 кДа
- Полоса 6: 50 кДа
- Полоса 7: 40 кДа
- Полоса 8: 30 кДа
- Полоса 9: 20 кДа

Мы рекомендуем хранить белковый стандарт MagicMark™ XP Western Protein Standard при -20 °C в аликвотах, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания. Он стабилен в течение 4 месяцев при правильном хранении.

За исключением нашего NativeMark Unstained Protein Standard (предназначенного для нативного электрофореза), все остальные неокрашенные и предварительно окрашенные стандарты, которые мы предлагаем (Invitrogen Sharp, SeeBlue, SeeBlue Plus2, BenchMark, HiMark), уже были предварительно восстановлены (запатентованным методом). Следовательно, вам не нужно добавлять восстановитель.