Автоматизированное устройство для вестерн-блоттинга iBind™

Нет, мы не предоставляем договоры на обслуживание или расширенные гарантии для этих приборов. Гарантия ограничена 1 годом с даты отгрузки.

Чтобы отмыть и повторно обработать блот, обработанный с использованием iBind Western Device или iBind Flex Western Device, сначала отмойте блот вне системы, используя предпочитаемый вами протокол. После протокола отмывки промойте блот в дистиллированной воде в течение 5 минут. Повторная блокировка не требуется, поскольку iBind Solution выполнит этот шаг во время повторной обработки. Наконец, повторно обработайте новыми антителами с помощью iBind Western Device или iBind Flex Western Device, начиная с этапа подготовки мембраны.

Find additional tips, troubleshooting help, and resources within our .

Да, для каждого миди-блота, мини-блота или вертикально разрезанной полоски подготовьте соответствующие первичные антитела вместе в одной пробирке с раствором iBind FD/ iBind Flex FD. Подготовьте соответствующие вторичные антитела вместе в другой пробирке с раствором iBind FD/ iBind Flex FD. Не смешивайте первичные и вторичные антитела перед загрузкой в устройство. Все первичные и вторичные антитела следует разводить в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководстве пользователя или краткой справочной карте. При обнаружении нескольких мишеней одного и того же вида можно использовать ту же концентрацию вторичных антител, что и при обнаружении одной мишени. Нет необходимости увеличивать концентрацию для каждой дополнительной мишени. Загрузите мультиплексированные антитела в устройство как обычно.
Предупреждение: Учитывайте перекрестную реактивность вторичных антител при мультиплексировании (например, кролик анти-козий IgG и коза анти-мышиный IgG, вероятно, будут перекрестно реагировать).

Да, и устройство iBind Western, и устройство iBind Flex Western хорошо работают с вторичными антителами, конъюгированными с Alexa Fluor Plus.

При достаточно сильном прижатии роликом карта iBind/iBind Flex будет слегка прогибаться в области мембраны, в результате чего верхняя и нижняя части карты приподнимутся. См. руководство пользователя iBind/iBind Flex для получения более подробной информации.

Вот возможные причины и решения:

- Плохой или неполный перенос: Повторите блоттинг.
- Мембранные прокладки грязные или загрязнены: Перед использованием замочите в моющем средстве и тщательно промойте очищенной водой. Замените прокладки, когда они изношены или обесцвечены.
- Мембрана не полностью влажная: Следуйте инструкциям по предварительному смачиванию мембраны.
- Мембрана загрязнена отпечатками пальцев или кератиновыми белками: Всегда надевайте чистые перчатки и используйте пинцет при работе с мембранами. Всегда берите мембраны за края.
- Неравномерная блокировка: Инкубационная чашка должна быть достаточно маленькой, чтобы обеспечить полное покрытие мембраны.
- Чернила, используемые для маркировки мембраны: Любая маркировка мембраны чернилами должна быть ограничена областью низкого ММ блота.
- iBind карта повреждена: Замените новой картой. Убедитесь, что прокатка мембраны на карте ограничена областью мембраны.
- Мембрана не находится в надлежащем контакте с iBind картой: Поместите мембрану на iBind карту сразу после добавления 1 мл пула 1X iBind раствора/ iBind FD раствора. Используйте прилагаемый ролик, чтобы обеспечить надлежащий контакт.

Вот возможные причины и решения:

- Повреждена карта iBind: Замените новой картой. Убедитесь, что скатывание мембраны на карте ограничено областью с надписью “membrane&#!48;.
- Стек был мокрым до запуска: Убедитесь, что на плоскую область карты iBind добавлено 5 мл 1X раствора iBind / раствора iBind FD. Избегайте добавления раствора в стек.
- Неправильное приготовление раствора iBind / раствора iBind FD: Приготовьте 1X раствор iBind / раствор iBind FD, как указано в руководстве.

Вот возможные причины и решения:

- Перегрузка белка: Уменьшите загрузку или разбавьте концентрацию образца.
- Плохой или неполный перенос: Повторите блоттинг.
- Слишком высокая концентрация первичных антител: Следуйте рекомендованному разведению поставщика или определите оптимальную концентрацию методом точечного блоттинга.

Вот возможные причины и решения:

- Плохой или неполный перенос: Повторите блот. После блоттинга окрасьте мембрану, чтобы измерить эффективность переноса. Используйте положительный контроль и/или маркер молекулярного веса.
- Мембрана не полностью смочена: Следуйте инструкциям по предварительному смачиванию мембраны.
- Слишком низкая концентрация первичного антитела: Следуйте рекомендованному поставщиком разведению или определите оптимальную концентрацию с помощью дот-блота.
- Неактивное первичное антитело: Определите активность, выполнив дот-блот.
- Низкое сродство первичного антитела к антигену: Получите первичное антитело с более высоким сродством.
- Загрязненный раствор вторичного антитела: Всегда надевайте перчатки и держите бутылки плотно закрытыми, когда они не используются. Используйте только очищенную воду при приготовлении реагентов.
- Интересующий белок вышел за пределы геля: Сопоставьте диапазон разделения геля с размером переносимого белка.
- Плохая задержка белков: Сопоставьте диапазон разделения геля с размером переносимого белка. Используйте маркер молекулярного веса с белками соответствующего размера. Более крупные белки требуют больше времени для переноса, более мелкие - меньше. Используйте мембрану с соответствующей связывающей способностью.
- Неправильное приготовление раствора iBind Solution/ iBind FD Solution: Приготовьте 1X iBind Solution/ iBind FD Solution, как указано в руководстве.
- Неправильное нанесение растворов в лунки iBind: Убедитесь, что растворы добавлены в правильные лунки и что лунки загружаются в числовом порядке.
- Блот неправильно помещен на карту iBind: Убедитесь, что белковая сторона блота находится в контакте с картой iBind и размещена в области с надписью «membrane».
- Стек мокрый перед запуском: Убедитесь, что 5 мл 1X iBind Solution/ iBind FD Solution добавлено на плоскую область карты iBind. Не добавляйте раствор в стек.
- Перекрестное загрязнение растворов в лунках: Не перемещайте устройство iBind Western во время работы.
- Карта iBind повреждена: Замените новой картой. Убедитесь, что перекатывание мембраны на карте ограничено областью с надписью «membrane».
- Мембрана не находится в надлежащем контакте с картой iBind: Поместите мембрану на карту iBind сразу после добавления 1 мл пула 1X iBind Solution/ iBind FD Solution. Используйте прилагаемый ролик, чтобы обеспечить надлежащий контакт.
- Устройство открыто до завершения работы: Устройство не следует открывать после того, как карта была помещена в устройство. Повторное запечатывание лунок на карте может привести к утечкам.
- Образец неправильно подготовлен; антигенность ослаблена или разрушена: SDS и восстанавливающие агенты могут мешать сродству некоторых антител/антигенов.
- Образец слишком разбавлен: Загрузите более высокую концентрацию или количество белка на гель.
- Белок слабо связан с мембраной: Убедитесь, что буфер для переноса содержит 10-20% метанола.
- Недостаточное время экспозиции: Повторно экспонируйте пленку в течение более длительного периода времени.
- Недостаточная инкубация с субстратом: Выполняйте каждый этап в течение указанного времени или удалите блот из субстрата, когда соотношение сигнал/шум приемлемо.
- Субстрат загрязнен: Всегда надевайте перчатки и держите бутылки плотно закрытыми, когда они не используются.
- Блоты слишком старые: Белок мог разрушиться со временем. Используйте свежеприготовленные блоты.

Вот возможные причины и решения:

- Мембрана загрязнена отпечатками пальцев или кератиновыми белками: Всегда надевайте чистые перчатки и используйте щипцы при работе с мембранами. Всегда берите мембраны только за края.
- Слишком высокая концентрация первичного антитела: Следуйте рекомендованному разведению от поставщика или определите оптимальную концентрацию методом дот-блота.
- Недостаточное удаление SDS/слабо связанных белков с мембраны после блоттинга: Следуйте инструкциям по подготовке мембраны перед иммунодетекцией, как указано в руководстве.
- Сродство первичного антитела к белковым стандартам: Уточните у производителя белковых стандартов наличие гомологий с первичным антителом.
- Неправильное приготовление раствора iBind Solution/ iBind FD Solution: Приготовьте раствор 1X iBind Solution/ iBind FD Solution в соответствии с инструкциями в руководстве.

Вот возможные причины и решения:

- Мембрана не полностью смочена: Следуйте инструкциям по предварительному смачиванию мембраны. Используйте инкубационную чашку, которая достаточно мала, чтобы обеспечить полное покрытие мембраны для предотвращения высыхания.
Примечание: Если используется PVDF-мембрана, мы рекомендуем убедиться, что она активирована метанолом, особенно если она высохла. Нет необходимости активировать PVDF-мембрану, которая только что вышла из трансфера и помещена в 1X раствор iBind / раствор iBind FD.
- Мембрана загрязнена: Используйте только чистые, новые мембраны. Всегда надевайте чистые перчатки и используйте пинцет при работе с мембранами.
- Пленка переэкспонирована или намокла во время экспозиции: Уменьшите время экспозиции или дайте сигналу еще больше ослабнуть. Предотвратите утечку, поместив мембрану в прозрачную пленку и промокните излишки субстрата с краев перед экспозицией.
- Растворы или инкубационный лоток загрязнены: Используйте чистую стеклянную посуду и очищенную воду для приготовления растворов. Замените или тщательно очистите лоток моющим средством для мытья стеклянной посуды. Тщательно промойте очищенной водой. Всегда надевайте чистые перчатки.
- Использованы концентрированные первичные антитела: Следуйте инструкциям, предоставленным в руководстве, чтобы разбавить первичные антитела или определить оптимальную концентрацию методом точечной иммунофильтрации (dot blot).
- Для PVDF использован неправильный хемилюминесцентный субстрат: Убедитесь, что используется реагент CDP-Star без усилителя.
- Блот перепроявлен: Следуйте рекомендованному времени проявления или удалите блот из субстрата, когда соотношение сигнал/шум станет приемлемым.
- Чернила, используемые для маркировки мембраны: Любая маркировка мембраны чернилами должна быть ограничена областью с низкой молекулярной массой блота.
- Неправильное приготовление раствора iBind / раствора iBind FD: Приготовьте 1X раствор iBind / раствор iBind FD, как указано в руководстве.
- Неправильное нанесение растворов в лунки iBind: Добавьте соответствующие растворы в каждую лунку в правильном числовом порядке, как указано в руководстве.
- Блот неправильно расположен на карте iBind: 1) Поместите мембрану в обозначенную область мембраны на карте iBind. 2) Белковая сторона блота должна соприкасаться с картой iBind. 3) Области с низкой молекулярной массой должны быть ближе всего к стеку. 4) Мембрана не должна соприкасаться со стеком.

Вот несколько дополнительных советов по снижению фона:

- Если используются стеки iBlot PVDF, убедитесь, что срок их годности не истек, так как фон увеличивается с возрастом. Использование стеков iBlot 2 PVDF поможет снизить фон.
- Убедитесь, что блот промыт в дистиллированной воде перед добавлением субстрата. Не промывайте в PBS или TBS.

Да, инструменты для обработки вестерн-блотов хорошо работают с реагентами WesternDot.

Да, приборы для обработки вестерн-блотов хорошо работают с вторичными антителами, меченными Alexa Fluor 680 и 790, и обеспечивают схожую или лучшую чувствительность по сравнению с ручной обработкой. Смотрите Рисунок 2 по следующей ссылке (http://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-assays-analysis/western-blotting/detect-proteins-western-blot/ibind-western-system.html?icid=fr-western-3).