Набор растворов iBind™

Чтобы отмыть и повторно обработать блот, обработанный с использованием iBind Western Device или iBind Flex Western Device, сначала отмойте блот вне системы, используя предпочитаемый вами протокол. После протокола отмывки промойте блот в дистиллированной воде в течение 5 минут. Повторная блокировка не требуется, поскольку iBind Solution выполнит этот шаг во время повторной обработки. Наконец, повторно обработайте новыми антителами с помощью iBind Western Device или iBind Flex Western Device, начиная с этапа подготовки мембраны.

Find additional tips, troubleshooting help, and resources within our .

Да, для каждого миди-блота, мини-блота или вертикально разрезанной полоски подготовьте соответствующие первичные антитела вместе в одной пробирке с раствором iBind FD/ iBind Flex FD. Подготовьте соответствующие вторичные антитела вместе в другой пробирке с раствором iBind FD/ iBind Flex FD. Не смешивайте первичные и вторичные антитела перед загрузкой в устройство. Все первичные и вторичные антитела следует разводить в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководстве пользователя или краткой справочной карте. При обнаружении нескольких мишеней одного и того же вида можно использовать ту же концентрацию вторичных антител, что и при обнаружении одной мишени. Нет необходимости увеличивать концентрацию для каждой дополнительной мишени. Загрузите мультиплексированные антитела в устройство как обычно.
Предупреждение: Учитывайте перекрестную реактивность вторичных антител при мультиплексировании (например, кролик анти-козий IgG и коза анти-мышиный IgG, вероятно, будут перекрестно реагировать).

Да, и устройство iBind Western, и устройство iBind Flex Western хорошо работают с вторичными антителами, конъюгированными с Alexa Fluor Plus.

Мы предлагаем набор iBind Solution и набор iBind Fluorescent Detection (FD) Solution. Для стандартной хемилюминесцентной или хромогенной детекции мы рекомендуем набор iBind Solution (Cat. No. SLF1020), а для флуоресцентной детекции мы рекомендуем набор iBind Fluorescent Detection (FD) Solution (Cat. No. SLF1019).

При достаточно сильном прижатии роликом карта iBind/iBind Flex будет слегка прогибаться в области мембраны, в результате чего верхняя и нижняя части карты приподнимутся. См. руководство пользователя iBind/iBind Flex для получения более подробной информации.

Вот возможные причины и решения:

- Плохой или неполный перенос: Повторите блоттинг.
- Мембранные прокладки грязные или загрязнены: Перед использованием замочите в моющем средстве и тщательно промойте очищенной водой. Замените прокладки, когда они изношены или обесцвечены.
- Мембрана не полностью влажная: Следуйте инструкциям по предварительному смачиванию мембраны.
- Мембрана загрязнена отпечатками пальцев или кератиновыми белками: Всегда надевайте чистые перчатки и используйте пинцет при работе с мембранами. Всегда берите мембраны за края.
- Неравномерная блокировка: Инкубационная чашка должна быть достаточно маленькой, чтобы обеспечить полное покрытие мембраны.
- Чернила, используемые для маркировки мембраны: Любая маркировка мембраны чернилами должна быть ограничена областью низкого ММ блота.
- iBind карта повреждена: Замените новой картой. Убедитесь, что прокатка мембраны на карте ограничена областью мембраны.
- Мембрана не находится в надлежащем контакте с iBind картой: Поместите мембрану на iBind карту сразу после добавления 1 мл пула 1X iBind раствора/ iBind FD раствора. Используйте прилагаемый ролик, чтобы обеспечить надлежащий контакт.

Вот возможные причины и решения:

- Повреждена карта iBind: Замените новой картой. Убедитесь, что скатывание мембраны на карте ограничено областью с надписью “membrane&#!48;.
- Стек был мокрым до запуска: Убедитесь, что на плоскую область карты iBind добавлено 5 мл 1X раствора iBind / раствора iBind FD. Избегайте добавления раствора в стек.
- Неправильное приготовление раствора iBind / раствора iBind FD: Приготовьте 1X раствор iBind / раствор iBind FD, как указано в руководстве.

Вот возможные причины и решения:

- Перегрузка белка: Уменьшите загрузку или разбавьте концентрацию образца.
- Плохой или неполный перенос: Повторите блоттинг.
- Слишком высокая концентрация первичных антител: Следуйте рекомендованному разведению поставщика или определите оптимальную концентрацию методом точечного блоттинга.

Вот возможные причины и решения:

- Плохой или неполный перенос: Повторите блот. После блоттинга окрасьте мембрану, чтобы измерить эффективность переноса. Используйте положительный контроль и/или маркер молекулярного веса.
- Мембрана не полностью смочена: Следуйте инструкциям по предварительному смачиванию мембраны.
- Слишком низкая концентрация первичного антитела: Следуйте рекомендованному поставщиком разведению или определите оптимальную концентрацию с помощью дот-блота.
- Неактивное первичное антитело: Определите активность, выполнив дот-блот.
- Низкое сродство первичного антитела к антигену: Получите первичное антитело с более высоким сродством.
- Загрязненный раствор вторичного антитела: Всегда надевайте перчатки и держите бутылки плотно закрытыми, когда они не используются. Используйте только очищенную воду при приготовлении реагентов.
- Интересующий белок вышел за пределы геля: Сопоставьте диапазон разделения геля с размером переносимого белка.
- Плохая задержка белков: Сопоставьте диапазон разделения геля с размером переносимого белка. Используйте маркер молекулярного веса с белками соответствующего размера. Более крупные белки требуют больше времени для переноса, более мелкие - меньше. Используйте мембрану с соответствующей связывающей способностью.
- Неправильное приготовление раствора iBind Solution/ iBind FD Solution: Приготовьте 1X iBind Solution/ iBind FD Solution, как указано в руководстве.
- Неправильное нанесение растворов в лунки iBind: Убедитесь, что растворы добавлены в правильные лунки и что лунки загружаются в числовом порядке.
- Блот неправильно помещен на карту iBind: Убедитесь, что белковая сторона блота находится в контакте с картой iBind и размещена в области с надписью «membrane».
- Стек мокрый перед запуском: Убедитесь, что 5 мл 1X iBind Solution/ iBind FD Solution добавлено на плоскую область карты iBind. Не добавляйте раствор в стек.
- Перекрестное загрязнение растворов в лунках: Не перемещайте устройство iBind Western во время работы.
- Карта iBind повреждена: Замените новой картой. Убедитесь, что перекатывание мембраны на карте ограничено областью с надписью «membrane».
- Мембрана не находится в надлежащем контакте с картой iBind: Поместите мембрану на карту iBind сразу после добавления 1 мл пула 1X iBind Solution/ iBind FD Solution. Используйте прилагаемый ролик, чтобы обеспечить надлежащий контакт.
- Устройство открыто до завершения работы: Устройство не следует открывать после того, как карта была помещена в устройство. Повторное запечатывание лунок на карте может привести к утечкам.
- Образец неправильно подготовлен; антигенность ослаблена или разрушена: SDS и восстанавливающие агенты могут мешать сродству некоторых антител/антигенов.
- Образец слишком разбавлен: Загрузите более высокую концентрацию или количество белка на гель.
- Белок слабо связан с мембраной: Убедитесь, что буфер для переноса содержит 10-20% метанола.
- Недостаточное время экспозиции: Повторно экспонируйте пленку в течение более длительного периода времени.
- Недостаточная инкубация с субстратом: Выполняйте каждый этап в течение указанного времени или удалите блот из субстрата, когда соотношение сигнал/шум приемлемо.
- Субстрат загрязнен: Всегда надевайте перчатки и держите бутылки плотно закрытыми, когда они не используются.
- Блоты слишком старые: Белок мог разрушиться со временем. Используйте свежеприготовленные блоты.

Вот возможные причины и решения:

- Мембрана загрязнена отпечатками пальцев или кератиновыми белками: Всегда надевайте чистые перчатки и используйте щипцы при работе с мембранами. Всегда берите мембраны только за края.
- Слишком высокая концентрация первичного антитела: Следуйте рекомендованному разведению от поставщика или определите оптимальную концентрацию методом дот-блота.
- Недостаточное удаление SDS/слабо связанных белков с мембраны после блоттинга: Следуйте инструкциям по подготовке мембраны перед иммунодетекцией, как указано в руководстве.
- Сродство первичного антитела к белковым стандартам: Уточните у производителя белковых стандартов наличие гомологий с первичным антителом.
- Неправильное приготовление раствора iBind Solution/ iBind FD Solution: Приготовьте раствор 1X iBind Solution/ iBind FD Solution в соответствии с инструкциями в руководстве.

Вот возможные причины и решения:

- Мембрана не полностью смочена: Следуйте инструкциям по предварительному смачиванию мембраны. Используйте инкубационную чашку, которая достаточно мала, чтобы обеспечить полное покрытие мембраны для предотвращения высыхания.
Примечание: Если используется PVDF-мембрана, мы рекомендуем убедиться, что она активирована метанолом, особенно если она высохла. Нет необходимости активировать PVDF-мембрану, которая только что вышла из трансфера и помещена в 1X раствор iBind / раствор iBind FD.
- Мембрана загрязнена: Используйте только чистые, новые мембраны. Всегда надевайте чистые перчатки и используйте пинцет при работе с мембранами.
- Пленка переэкспонирована или намокла во время экспозиции: Уменьшите время экспозиции или дайте сигналу еще больше ослабнуть. Предотвратите утечку, поместив мембрану в прозрачную пленку и промокните излишки субстрата с краев перед экспозицией.
- Растворы или инкубационный лоток загрязнены: Используйте чистую стеклянную посуду и очищенную воду для приготовления растворов. Замените или тщательно очистите лоток моющим средством для мытья стеклянной посуды. Тщательно промойте очищенной водой. Всегда надевайте чистые перчатки.
- Использованы концентрированные первичные антитела: Следуйте инструкциям, предоставленным в руководстве, чтобы разбавить первичные антитела или определить оптимальную концентрацию методом точечной иммунофильтрации (dot blot).
- Для PVDF использован неправильный хемилюминесцентный субстрат: Убедитесь, что используется реагент CDP-Star без усилителя.
- Блот перепроявлен: Следуйте рекомендованному времени проявления или удалите блот из субстрата, когда соотношение сигнал/шум станет приемлемым.
- Чернила, используемые для маркировки мембраны: Любая маркировка мембраны чернилами должна быть ограничена областью с низкой молекулярной массой блота.
- Неправильное приготовление раствора iBind / раствора iBind FD: Приготовьте 1X раствор iBind / раствор iBind FD, как указано в руководстве.
- Неправильное нанесение растворов в лунки iBind: Добавьте соответствующие растворы в каждую лунку в правильном числовом порядке, как указано в руководстве.
- Блот неправильно расположен на карте iBind: 1) Поместите мембрану в обозначенную область мембраны на карте iBind. 2) Белковая сторона блота должна соприкасаться с картой iBind. 3) Области с низкой молекулярной массой должны быть ближе всего к стеку. 4) Мембрана не должна соприкасаться со стеком.

Вот несколько дополнительных советов по снижению фона:

- Если используются стеки iBlot PVDF, убедитесь, что срок их годности не истек, так как фон увеличивается с возрастом. Использование стеков iBlot 2 PVDF поможет снизить фон.
- Убедитесь, что блот промыт в дистиллированной воде перед добавлением субстрата. Не промывайте в PBS или TBS.

Помимо того, что карта iBind Flex примерно в 1,7 раза шире, она также включает в себя линии выравнивания, напечатанные на обратной стороне, которые появляются при добавлении раствора на карту, чтобы помочь в правильном горизонтальном размещении нескольких мини-блотов или вертикально разрезанных стрип-блотов.

Составы идентичны как для стандартных растворов, так и для растворов для флуоресцентной детекции (FD). Единственное различие заключается в поставляемом количестве, поэтому наборов iBind Flex Solution Kits достаточно для 10 миди-блотов, 20 мини-блотов или 60 вертикально разрезанных стрип-блотов.

Пожалуйста, используйте протокол, упомянутый на Странице 13 руководства (https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/ibind_man.pdf) при использовании iBind Western System в сочетании с LI-COR Odyssey Imaging System. Мы не рекомендуем использовать раствор LI-COR.

Системы iBind Western – это настольные устройства, которые автоматизируют этапы иммунодетекции. Эти устройства не используют внешний источник питания и полагаются на механическое давление для создания последовательного латерального потока (SLF) иммунодетекционных реагентов, чтобы выполнять блокировку, связывание антител и отмывки без участия рук для рабочих процессов вестерн-блоттинга.

Доступны две системы iBind Western:
i) содержащая оригинальное устройство iBind Western Device, которое вмещает один мини-блот за раз
ii) содержащая устройство iBind Flex Western Device, которое вмещает один или два мини-блота, один миди-блот или до шести вертикально разрезанных полосок мембраны (для отдельных антител) за раз.

Если PVDF-мембрана высохла, важно предварительно активировать ее 100% метанолом, а затем промыть в дистиллированной воде перед погружением в раствор iBind/раствор iBind Fluorescent Detection (FD). Нет необходимости активировать PVDF-мембрану, которая только что вышла из трансферного блока и была помещена в раствор iBind/раствор iBind Fluorescent Detection (FD).

Промывайте устройство iBind Western под проточной водой после каждого использования и дайте ему высохнуть перед дальнейшим использованием. Не рекомендуется использовать моющие средства, так как любые остатки моющего средства могут повлиять на результаты.Чтобы максимально продлить срок службы пружин в устройстве iBind Western, храните устройство с разблокированной защелкой и открытой крышкой, как показано на странице 23 руководства.

Достаточно заблокировать мембрану в растворе iBind / растворе для флуоресцентной детекции iBind (FD) на время, необходимое для приготовления разведений антител. Нет необходимости блокировать мембрану на ночь в блокирующем растворе. Мембрана будет подвергнута дополнительной блокировке в растворе iBind / растворе для флуоресцентной детекции iBind (FD) до того, как первичное антитело достигнет мембраны.

Да, мембраны меньшего размера, чем 9 см x 9 см, можно использовать с устройством iBind Western. Рекомендуется размещать полоски или меньшие блоты по центру. При использовании мембран большего размера необходимо следить за тем, чтобы никакая часть мембраны не соприкасалась со стопкой на карте iBind.

Мы не рекомендуем использовать собственные растворы. Раствор iBind и раствор iBind Fluorescent Detection (FD) обладают определенной вязкостью и оптимизированы для последовательного бокового потока, который является принципом работы устройства iBind Western. Мы не можем гарантировать производительность при использовании других растворов.

Оригинальная система iBind Western (кат. № SLF1000) состоит из:
- Устройство iBind Western
- Валик для блоттинга iBind
- Крышка окна iBind

Вам потребуется приобрести следующие предметы отдельно:
- Карты iBind (кат. № SLF1010)
- Набор растворов iBind (кат. № SLF1020) для приготовления блокирующих, разбавляющих и промывочных буферов для хемилюминесцентной или хромогенной детекции
- Набор растворов для флуоресцентной детекции iBind (кат. № SLF1019) для приготовления блокирующих, разбавляющих и промывочных буферов для флуоресцентной детекции
- Набор для хемилюминесцентной детекции AP Mouse Invitrogen (кат. № SLF1021) или Набор для хемилюминесцентной детекции AP Rabbit Invitrogen (кат. № SLF1022)