Geltrex™ LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix: Матрикс для клеточных исследований

Хотя стандартный экстракт базальной мембраны (BME) содержит факторы роста, такие как EGF, IGF‐1, PDGF и TGF‐beta, экстракт базальной мембраны с пониженным содержанием факторов роста (матрикс Geltrex) содержит EGF, PDGF и NGF ниже определяемого уровня. Он по-прежнему содержит некоторое количество TGF‐beta (около 2 нг/мл) и в среднем в 3 раза меньше IGF‐1, чем обычный BME, отсюда и обозначение «сниженный». Ни стандартный, ни сниженный BME не содержат NGF или FGF‐2.

Мы рекомендуем наносить тонкое (не образующее гель) покрытие на чашки диаметром 35 мм с использованием 1,5 мл Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix (кат. № A1413201, A1413202) или Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix (кат. № A1413301, A1413302), предварительно разбавленного в 1/100 в среде DMEM/F-12 (1% конечная концентрация).

Да, вы можете повторно замораживать и использовать Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix. Однако следует избегать многократных циклов замораживания/оттаивания. Поэтому мы рекомендуем следующее:

1. Разморозьте Geltrex Matrix в холодильнике на ночь при температуре 2-8 градусов C.
2. Перемешайте раствор Geltrex Matrix медленным пипетированием вверх и вниз. Будьте осторожны, чтобы не образовались пузырьки воздуха.
3. Если вы не используете весь раствор, подготовьте несколько аликвот либо исходного раствора, либо разбавленного, и заморозьте.

ЭС клетки человека обычно характеризуются их типичной морфологией (они растут в виде плотно упакованных кластеров маленьких клеток с высоким соотношением ядра к цитоплазме); экспрессией поверхностных маркеров; RT-PCR обнаружением экспрессии генов, специфичных для стволовых клеток (таких как Oct3/4, Sox2 и Nanog); окрашиванием щелочной фосфатазой и анализом активности теломеразы. Наиболее часто используемые ES-специфические поверхностные маркеры включают эмбриональные антигены, специфичные для стадии, SSEA-3 и SSEA-4 для ЭС клеток человека. Другие ES-специфические поверхностные антигены также включают TRA-1-60 и TRA-1-81.

Эмбриональные стволовые клетки человека получают из внутренних клеточных масс человеческих бластоцист, выделенных с помощью иммунохирургии с кроличьей антисывороткой к клеткам BeWO (линия клеток трофобласта человека) (Science 282:1145 (1998)).

Эмбриональные стволовые (ЭС) клетки получают из раннего эмбриона млекопитающих и способны к неограниченной, недифференцированной пролиферации in vitro, сохраняя при этом свой потенциал к дифференцировке в широкий спектр тканей взрослого организма, включая половые клетки. Плюрипотентность ЭС-клеток обычно демонстрируется in vitro путем индуцирования дифференцировки ЭС-клеток в эмбриоидные тельца и проверки маркеров, специфичных для линий дифференцированных клеток в трех зародышевых листках (эндо, мезо и эктодерма), или путем введения их иммунодефицитным мышам и определения типов клеток, образующихся в тератомах.

Вирус, повышающий уровень лактатдегидрогеназы (LDEV), инфицирует макрофаги мышей и вызывает персистентные инфекции у лабораторных мышей. LDEV, РНК-вирус, изменяет физиологию in vivo и является распространенным загрязнителем биологических материалов, полученных из трансплантируемых линий опухолевых клеток.

Да, попробуйте различные разведения для покрытия планшетов. Некоторые клиенты используют разведение 1:100 и получают лучшие результаты. Оптимальное разведение зависит от клеточной линии.

Geltrex Matrix — это экстракт базальной мембраны, который содержит коллаген IV, ламинин и другие матриксные белки и факторы роста, необходимые для адгезии клеток. AlgiMatrix Matrix содержит только альгинат, который не способствует адгезии клеток. В альгинатных губках нет ничего, с чем могли бы взаимодействовать клетки.

Да, это нормально. Это наблюдалось в процессе разработки продукта. Удалите раствор Gibco Geltrex Matrix после предварительного покрытия и добавьте клетки как обычно. Человеческие эмбриональные стволовые клетки H9 культивировались на чашках, предварительно покрытых готовой к использованию матрицей Gibco Geltrex, с этим наблюдением в процедуре предварительного покрытия.

Если вы хотите культивировать клетки после извлечения из матрикса, мы рекомендуем сначала промыть клетки, а затем использовать трипсин/ЭДТА, реагент TrypLE или раствор коллагеназы (3000 ЕД/мл) и гиалуронидазы (1000 ЕД) в DMEM с низким содержанием глюкозы. Если вы хотите отслеживать маркеры клеточной поверхности, мы рекомендуем удалять клетки механическим путем, например, интенсивной промывкой или осторожным соскабливанием.

Обратите внимание, что фенотип клеток может измениться, если их культивировать в 2D после удаления из матрикса.

Да, эти продукты были разработаны для совместной работы.

Gibco Geltrex Matrix – это растворимая форма экстракта базальной мембраны с пониженным фактором роста (RGF), очищенная из мышиной опухоли Engelbreth-Holm-Swarm. Исторически эти препараты содержали вирус, повышающий уровень лактатдегидрогеназы (LDEV), который не влияет на характеристики материала, но может вызывать опасения в определенных применениях, таких как ксенотрансплантаты или другие клинически ориентированные исследования. В настоящее время доступны новые методы производства, позволяющие удалять этот вирус. Полученный материал, не содержащий LDEV, тестируется с использованием методов ПЦР для подтверждения отсутствия вируса.

Gibco Geltrex Matrix и коллаген (крысиный хвост и бычий) можно использовать как в качестве раствора для покрытия, так и в качестве трехмерного гелевого матрикса. CELLstart Substrate был разработан для использования в качестве ксеногенной подложки только для ESC приложений (в качестве заменителя Gibco Geltrex Matrix или Matrigel Matrix, которые имеют животное происхождение). AlgiMatrix Matrix представляет собой трехмерный матрикс каркасного типа, который не поддерживает прикрепление клеток, но обеспечивает хорошую среду для выращивания сфероидов, которые можно легко собрать для последующих применений.