GeneChip™ miRNA 4.0 Assay: Анализ микроРНК для исследований

Зонды для snoRNA, scaRNA и шпилек выбираются таким образом, чтобы максимизировать реакцию зонда на концентрацию мишени в образце, минимизируя при этом перекрестную гибридизацию с другими потенциальными мишенями в образце. Чтобы минимизировать перекрестную гибридизацию, потенциальные мишени выводятся из массива известных последовательностей из входного набора данных и используются в процессе фильтрации, называемом прореживанием, который штрафует кандидатов в зонды, которые могут перекрестно гибридизоваться с нежелательными мишенями. По мере улучшения массива известных последовательностей мы можем улучшить наш набор для прореживания, чтобы избежать кандидатов в зонды, которые ранее считались уникальными. Улучшенный набор для прореживания снизит вероятность перекрестной гибридизации зонда с нежелательной мишенью, улучшив представление набора зондов для предполагаемой мишени. В результате улучшенного выбора зондов требуется меньше наборов зондов для представления того же количества последовательностей.

Зонды на микрочипе обнаруживают прямую (sense) последовательность-мишень.

Для нормализации следует использовать не менее 5 miRs или SnoRNAs:

RU44, RU48 и/или U6 микроРНК, которые не изменяются между вашими образцами и как минимум в 5 раз превышают фоновый уровень, согласно вашим микрочипам. Эти miRs могут включать miR 15,16, 17 или let 7a, let 7b, let7c

Все 5 (или более) этих РНК не должны демонстрировать никаких изменений между образцами. Усредните некоторые или все из них, чтобы получить коэффициент нормализации, и примените к своим данным qRT-PCR.

qPCR пока не является золотым стандартом для валидации miRNA. В отличие от валидации мРНК, где ампликон уже присутствует в образце, для miRNA qPCR требуется, чтобы ампликон был синтезирован путем объединения образца либо со специально разработанной молекулой шпильки, добавления 3' полиА хвоста или другой манипуляции с образцом микроРНК. Процесс построения ампликона будет отличаться от образца к образцу и приведет к вариабельности результатов ПЦР. Однако по-прежнему очень важно подтвердить результаты микрочипов другим методом, таким как ПЦР. Тенденции повышения и понижения регуляции должны совпадать по направлению, даже если они не совпадают по величине.

F Sato. Intra-Platform Repeatability and Inter-Platform Comparibility of microRNA microarray technology. PLoS ONE May 2009, volume 4, issue 5, e5540.
D Sarkar. Quality Assessment and data analysis for microRNA expression arrays. Nucleic Acids Research 2009, vol. 37, no. 2, e17 (doi: 10.1093/ner/gkn932).

Большинство исследователей исключают нерелевантные виды из анализа, потому что дополнительные данные могут быть обременительными. Однако, рассмотрение проб, относящихся к нескольким видам, может повысить уверенность в данных. Мы обычно наблюдаем кластеризацию межвидовых miR, которые идентичны или почти идентичны.

У нас нет конкретных рекомендаций. Высококачественный образец РНК будет иметь соотношение не менее 1,95. Однако, если микроРНК присутствуют в образцах с более низкими значениями 260:280, эти образцы все равно можно использовать.

Обработка ДНКазой является необязательной. Она не требуется для образцов РНК, содержащих следовые количества геномной ДНК, но может быть полезна для образцов РНК, сильно загрязненных геномной ДНК, чтобы более точно количественно определить РНК. После обработки РНК ДНКазой крайне важно полностью инактивировать ДНКазу, прежде чем приступать к процедуре FlashTag, чтобы предотвратить деградацию реагента FlashTag (флакон 5). Для инактивации ДНКазы можно использовать различные колонки/наборы для очистки РНК. Инактивация ДНКазы высокой температурой может не полностью инактивировать фермент.

Для точного определения концентрации образца РНК мы рекомендуем использовать набор Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit (кат. № R11490) или спектрофотометр NanoDrop ND-1000.

Как тотальная РНК, так и низкомолекулярная РНК (LMW) могут быть помечены с помощью FlashTag Biotin HSR. Использование тотальной РНК может сэкономить время и деньги, а также предотвратить потерю образца.

Любой набор для очистки тотальной РНК или LMW (РНК с низкой молекулярной массой) будет совместим с FlashTag Biotin HSR. Элюируйте или ресуспендируйте РНК в воде, не содержащей нуклеаз. Убедитесь, что метод очистки сохраняет низкомолекулярные виды. Некоторые коммерческие продукты, которые были успешно протестированы с FlashTag Biotin HSR, включают:

mirVana miRNA Isolation Kit
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE
PureLink miRNA Isolation Kit
TRIzol reagent (только тотальная РНК) с дополнительной стадией осаждения в изопропаноле при -20 градусах C в течение ночи.