GeneChip™ 3' IVT PLUS Reagent Kit, 30 реакций

Пожалуйста, обратитесь к Руководству по реагентам для микрочипов и наборов для экспрессии, чтобы подобрать правильные реагенты для вашей матрицы.

Для анализов IVT значение RIN должно быть 6 или выше. Для анализов WT нет рекомендаций, основанных на праймировании анализа.

Последовательности всех наших контролей можно скачать из файла последовательностей, который доступен на страницах продуктов на thermofisher.com.

Например, вот ссылка на страницу продукта для Clariom D Assay, human:
Перейдите в раздел "Software & Data Analysis" и в подразделе "Support Files" нажмите на "Sequence Files: Clariom D Array, human Probe Sequences, tabular format", который вы можете открыть в Excel.

Примечание: Если файл контрольных последовательностей недоступен, пожалуйста, свяжитесь с нами.

Базы данных псевдогенов не были включены в дизайн экспрессионных микрочипов.

Первое разведение контрольного образца Poly-A RNA можно хранить при -20 градусах C в течение 6 недель (до 4 циклов заморозки/разморозки).

Меченый материал можно хранить в течение 2 недель при -20 градусах C.

Типичный срок годности для микрочипов анализа экспрессии генов следующий:
- Все коммерческие картриджи для анализа экспрессии генов ≥ 8 мкм стабильны до 24 месяцев.
- Все коммерческие картриджи для ресеквенирования ≥ 8 мкм стабильны до 18 месяцев.
- Все коммерческие планшеты для анализа экспрессии генов ≥ 8 мкм стабильны до 18 месяцев.

Пожалуйста, обратите внимание, что это не относится к таким продуктам, как Exon или Gene array, поскольку они представляют собой картриджи и планшеты размером 5 мкм.

Control Oligo B2 (3 nM) — это предварительно меченый ДНК-контроль, необходимый для гибридизации с контрольными зондами на массиве. Это нужно для выравнивания сетки с помощью AGCC. Если Control Oligo B2 не будет включен в гибридизационный коктейль, программное обеспечение не сможет наложить сетку на отсканированное изображение, что приведет к невосполнимой потере данных образца с массива. Отсутствие Control Oligo B2 также лишает клиента возможности подать запрос на замену массива.

Рекомендуемое исходное количество общей РНК на образец составляет 100 нг при соблюдении стандартного протокола. В качестве минимального значения можно использовать 50 нг.

Мы рекомендуем использовать тотальную РНК в качестве исходного материала для набора реагентов GeneChip 3' IVT PLUS. Этот набор не был валидирован для использования с мРНК.

Путем титрования геномной ДНК обратно в образцы тотальной РНК и мониторинга ухудшения данных массива было определено во время разработки анализа, что умеренное количество загрязнения геномной ДНК будет оказывать лишь минимальное влияние на результаты массива. Таким образом, стандартные методы выделения РНК в сочетании с обработкой ДНКазой должны давать достаточно высококачественный образец для анализа на экзонных массивах.

Все продукты senseRNA, cRNA и cDNA, полученные с использованием GeneChip WT PLUS Reagent Kit и GeneChip 3' IVT PLUS Reagent Kit, могут храниться при -20 градусах C.

Да, для микрочипов GeneChip можно использовать как поли(A)+ мРНК, так и тотальную РНК в качестве входного материала. Протоколы, представленные в руководстве, описывают процедуры подготовки биотинилированной целевой РНК как из очищенной эукариотической поли(A)+ мРНК, так и из образцов тотальной РНК. Высококачественная мРНК была успешно выделена из клеток и тканей млекопитающих с использованием специальных наборов, и эта мРНК может быть использована в качестве матрицы для синтеза кДНК. Однако важно отметить, что результаты, полученные из образцов, подготовленных с использованием разных методов (тотальная РНК против поли(A)+ мРНК), могут быть неидентичными, поэтому рекомендуется сравнивать только образцы, подготовленные с использованием одного и того же протокола подготовки образцов.

Да, высокое содержание рибосомной РНК (рРНК) может влиять на процесс амплификации. Рибосомные РНК — это самые распространенные типы РНК, присутствующие в клетках, и они могут конкурировать с матричными РНК (мРНК), которые обычно являются мишенями, связывающимися с зондами на массиве, во время обратной транскрипции и амплификации. Эта конкуренция может привести к менее эффективной амплификации мРНК, что может повлиять на общее качество и надежность полученных данных.
Однако важно отметить, что это не обязательно вызывает "случайную" амплификацию праймеров.
Праймеры, используемые на этих этапах, разработаны для специфичного связывания с мРНК, в зависимости от используемого анализа, а также от зондов на массиве, поэтому присутствие избыточного количества рРНК не должно приводить к их связыванию и амплификации случайных последовательностей. Но это может снизить эффективность амплификации специфических последовательностей, для которых предназначены зонды.
В качестве наилучшей практики, в зависимости от природы входного материала, мы часто рекомендуем удалять рРНК из образцов перед выполнением этих этапов, особенно при работе с образцами тотальной РНК. Существует несколько коммерчески доступных наборов и методов для удаления рРНК.

Были проведены внутренние исследования для сравнения данных, полученных из 1 мкг и 5 мкг исходной общей РНК, и результаты микрочипов показали высокую согласованность в отношении чувствительности обнаружения (процент Present call) и воспроизводимости (корреляция сигналов, абсолютная согласованность Call). Однако были обнаружены незначительные различия. Поэтому для лучшей сопоставимости результатов обычно рекомендуется использовать одинаковое количество исходной РНК в исследованиях, где данные предназначены для прямого сравнения.

В набор IVT Labeling Kit входит запатентованный биотинилированный аналог нуклеотида (патент заявлен). Этот аналог включается в реакцию IVT-амплификации и мечения, опосредованную РНК-полимеразой T7, в качестве псевдоуридинового реагента для получения мишеней кРНК.

Образцы тотальной РНК должны быть свободны от геномной ДНК, и мы рекомендуем включать обработку ДНКазой в метод очистки РНК. Загрязняющая геномная ДНК может быть амплифицирована вместе с РНК, что может привести к неточному измерению экспрессии всего транскриптома. Кроме того, загрязняющая геномная ДНК может привести к завышению количества РНК.​
Мы настоятельно не рекомендуем использовать методы на основе нуклеиновых кислот и те, которые содержат гликогеновые носители, во время очистки РНК, поскольку многие из них, как было показано, производят продукты кДНК в реакции синтеза первой цепи. Выберите метод очистки или имеющийся в продаже набор, подходящий для вашего количества образца. Для ограниченного количества клеток выбирайте методы очистки, которые позволяют очищать препараты тотальной РНК из небольших количеств.

Линеаризованная плазмидная ДНК входит в этот набор в качестве положительного контроля. Используя ее в качестве матрицы, пользователи могут протестировать транскрипционную активность компонентов набора. Следуя протоколу, изложенному в инструкции к набору, контроль можно использовать для отслеживания выхода и консистенции размера продукта, создаваемого набором.

Было показано с помощью электрофореза, что длина продуктов cRNA не изменяется с увеличением времени реакции IVT. Кроме того, результаты, полученные после изменения длительности инкубации IVT, хорошо согласуются с результатами, полученными при более коротком времени инкубации, и показывают незначительные или вовсе не обнаруживаемые различия.

Это изменение в протоколе имеет два основных преимущества. Во-первых, оно дает возможность начинать с небольшого количества общей РНК, всего 1 мкг, используя стандартный протокол One-Cycle Labeling. Во-вторых, оно включает в себя более удобный и эффективный рабочий процесс.

Ранее IVT проводилась с 4-5 часовой инкубацией во второй день стандартного протокола One-Cycle Target Labeling. Это делало процедуру во второй день довольно напряженной, так как пользователи обычно выполняли очистку цРНК (около 30 минут) и фрагментацию (около 1 часа) после IVT, чтобы гибридизировать свои образцы на массивах в течение ночи.

Чтобы сделать рабочий процесс более гибким, новый GeneChip IVT Labeling Kit предоставляет общую рекомендацию использовать инкубацию в течение ночи. Однако, для клиентов, которые предпочитают предыдущий протокол, у них есть возможность добавить дополнительную T7 РНК-полимеразу (Ambion, P/N 2085, как описано в инструкции к продукту), чтобы сократить время реакции IVT до 4-5 часов.