CTS™ LV-MAX™ Production Medium, 1 L

Продукты LV-MAX и CTS LV-MAX имеют эквивалентные характеристики. В отличие от продуктов LV-MAX, предназначенных только для исследовательских целей, продукты CTS LV-MAX имеют дополнительное предназначение для клеточной и генной терапии и дополняются более надежным пакетом нормативной поддержки для обеспечения клинического терапевтического применения. Это означает, что мы в меру своих возможностей поддерживаем спецификации и требования к выпуску нашей продукции CTS в соответствии с последними нормативными указаниями, относящимися к этому конкретному применению.

Мы рекомендуем использовать 96-луночные планшеты с V-образным дном для сбора супернатанта, содержащего лентивирусные частицы, поскольку они позволяют легче обнаруживать осадок клеток после центрифугирования культур.

Нет, клетки CTS для производства вирусных частиц – это клетки HEK 293F, находящиеся в суспензии и адаптированные к среде CTS LV-MAX Production Medium. Они не экспрессируют большой Т-антиген SV40.

Наша продукция LV-MAX предназначена только для исследовательского использования, в то время как наша продукция CTS LV-MAX предназначена для исследовательского использования или производства клеточных, генных или тканевых продуктов. Пожалуйста, обратитесь к информации о конкретных продуктах для получения более подробной информации о заявленном назначении.

Мы рекомендуем содержать культуры на шейкере в отдельном инкубаторе от всех других инкубаторов, чтобы избежать влияния вибрации. В качестве альтернативы, для удобства и наилучшей производительности мы рекомендуем использовать небольшой, тихий шейкер, например, Thermo Scientific CO₂ Resistant Shaker (Кат. № 88881102).

Клетки для производства вируса CTS можно замораживать непосредственно в криогенной среде, состоящей из 90% среды CTS LV-MAX Production Medium и 10% ДМСО. Вот протокол:

- Сохраняйте клетки на 3-м пассаже, когда плотность клеток достигнет ≥3,0-4,5 x 10E6 жизнеспособных клеток/мл при >95% жизнеспособности.
- Центрифугируйте клетки при 100 x g (низкая скорость) в течение 5 минут для осаждения. Вылейте отработанную среду.
- Подготовьте среду для замораживания: например, 10 мл среды для замораживания – это 9 мл CTS LV-MAX Production Medium + 1 мл ДМСО; хорошо перемешайте и стерилизуйте фильтрацией 0,2 мкм.
- Ресуспендируйте клеточный осадок в подготовленной среде для замораживания.
- Разбавьте клетки до конечной плотности 10 x10E6 жизнеспособных клеток/мл и разлейте по 1 мл в криопробирки.
- Заморозьте клетки при -80 градусах C на 1 день.
- Перенесите замороженные пробирки в жидкий азот для длительного хранения.

Как правило, мы рекомендуем культивировать клетки CTS Viral Production в условиях 8% CO₂. Мы обнаружили, что клетки, культивируемые в 5% CO₂, росли медленнее и были более склонны к образованию комков клеток, чем при выращивании в 8% CO₂.

Система производства лентивирусов CTS LV-MAX – это полностью оптимизированная комплексная система, в которой клетки, среда и реагент для трансфекции работают вместе для получения лентивирусов с высоким титром. Среда CTS LV-MAX Production Medium специально разработана для работы с этой системой и поддержки роста клеток CTS Viral Production Cells в суспензионной культуре с высокой плотностью.

Хотя 3-4 пассажа перед трансфекцией достаточно для большинства клеточных линий, восстанавливающихся непосредственно из жидкого азота, мы обнаружили, что CTS Virus Production Cells, пассированные до P5, демонстрируют наивысшую производительность при производстве лентивирусных частиц и воспроизводимость между партиями. Поэтому мы рекомендуем пассировать клетки до P4 в конце данной недели для производства лентивируса на следующей неделе.

Для оптимального восстановления клеток после хранения в жидком N2, клетки CTS Viral Production Cells следует пассировать до пассажа 2 (P2) (из исходного флакона) и до P3 перед заморозкой, чтобы обеспечить хорошее здоровье и жизнеспособность клеток. Клетки, демонстрирующие хорошее здоровье (т.е. время удвоения ˜26 часов, округлая морфология клеток и минимальное слипание), могут быть заморожены на P2 или P3.

Пассирование клеток CTS Viral Production Cells каждые 3-4 дня позволяет темпам роста клеток прогрессировать от фазы задержки до логарифмической фазы, что обеспечивает наивысшую жизнеспособность клеток после разделения культур. Мы рекомендуем пассировать клетки с плотностью не ниже ˜0,35x10E6 жизнеспособных клеток/мл, поскольку низкая плотность клеток, поддерживаемая в фазе задержки в течение длительного времени, в конечном итоге приведет к плохому общему росту клеток. Мы не рекомендуем культивировать клетки более 4 дней.

Плотность клеточной культуры для клеток CTS Viral Production Cells следующая:
- 0,35x10E6 и 0,55x10E6 жизнеспособных клеток/мл (плотность клеток при разделении для 4-дневной и 3-дневной культуры, соответственно)
- 3,5x10E6 до 5x10E6 жизнеспособных клеток/мл (плотность клеток при пересеве)
- Логарифмическая фаза: от 0,35x10E6 до 6,5x10E6 жизнеспособных клеток/мл.

При размножении лентивирусных экспрессионных плазмид важно размножать их в клетках, которые минимизируют любые перестройки последовательности или нежелательную рекомбинацию из-за длинных концевых повторов (LTR) и большого размера вектора (˜10 Kb). Чтобы минимизировать эти события, мы рекомендуем использовать клетки Stbl3 для стабильного размножения лентивирусных экспрессионных плазмид.

Мы рекомендуем использовать либо метод GFP, либо метод на основе антибиотиков, описанный в руководстве. Вы можете попробовать другие методы определения титра вируса, однако у нас нет протоколов для методов, отличных от GFP или антибиотиков.

Низкий титр лентивирусов может быть обусловлен множеством различных факторов, таких как неоптимизированный дизайн лентивирусного экспрессионного вектора, низкая эффективность трансфекции, неправильная плотность клеток, неоптимальные условия культивирования (например, инкубатор, скорость шейкера, тип сосуда, загрязнение среды), стратегия очистки и метод титрования. Чтобы лучше отслеживать ваш рабочий процесс от культивирования клеток до титрования лентивируса, мы рекомендуем использовать положительный контроль.

Это может означать, что посевная или начальная плотность клеток была слишком низкой. Добавка CTS LV-MAX Supplement полагается на высокую плотность клеток. Обратитесь к руководству по системе производства лентивирусных векторов CTS LV-MAX для получения рекомендаций по плотности клеток.

Антиагреганты потенциально могут ингибировать эффективность трансфекции и обычно не рекомендуются. При необходимости добавьте не более 0,1% Pluronic F-68

Система производства лентивирусов CTS LV-MAX разработана для совместимости с любым форматом плазмидной ДНК. Качество плазмид (например, чистота), соотношение плазмид и конструкция вектора - все это влияет на титр лентивирусов.

Состав CTS LV-MAX Enhancer в сочетании с широким временным окном для добавления энхансера был специально оптимизирован для обеспечения гибкости пользователя в отношении графика и времени начала протокола без ущерба для производительности. Для достижения оптимальных результатов мы рекомендуем придерживаться предложенного временного интервала для добавления энхансера.

Производственная среда CTS LV-MAX специально разработана для поддержания здоровья клеток, используемых для производства вирусных частиц, культивируемых с высокой плотностью. Мы провели всесторонние внутренние исследования и определили, что нет необходимости в смене среды во время протокола.

Пожалуйста, обратитесь к странице 31 руководства пользователя для ознакомления с протоколом измерения титра лентивирусов с использованием селекции антибиотиками.

Последовательности плазмид LV-MAX Lentiviral Packaging Mix опубликованы на нашем веб-сайте; однако соотношение плазмид в смеси является конфиденциальным.

Мы рекомендуем использовать упаковочные и трансферные плазмиды лентивирусов в соотношении 3:2.

Наша система оптимизирована для обеспечения максимальной выработки лентивируса через 48 часов после трансфекции. Ожидание до 72 часов не рекомендуется, так как существующие лентивирусные частицы в среде инфицируют клетки-продуценты и могут снизить титр.

Пассажи следует считать после разморозки, и клетки следует утилизировать, когда они достигнут 20-го пассажа после разморозки.

Мы рекомендуем использовать CTS Viral Production Cells для производства лентивирусов только после пассажа 5, чтобы клетки могли полностью восстановиться после криоконсервации; CTS Viral Production Cells чувствительны после оттаивания и нуждаются в дополнительных пассажах для восстановления.

Это необходимый шаг для пополнения питательных веществ и обеспечения нужной плотности клеток для достижения концентрации, необходимой для оптимальной эффективности трансфекции. Очень важно, чтобы клетки имели надлежащую плотность во время трансфекции, чтобы обеспечить максимальную производительность.

В зависимости от того, будет ли ваша культура 3 или 4 дня, мы описали различия в плотности посева в руководстве пользователя к продукту.

У нас также есть конкретные рекомендации по плотности посева, которые следует использовать для производства лентивирусных векторов.

Мы постоянно разрабатываем протоколы для крупномасштабного производства для поддержки клинического и коммерческого производства лентивирусных векторов. В настоящее время мы работаем над масштабами 5 л и 50 л.

Допустимы колебания жизнеспособности после разморозки, но они должны нормализоваться в последующих пассажах. Мы рекомендуем культивировать клетки, как описано в главе 2 руководства, чтобы клетки достаточно восстановились и достигли >90% жизнеспособности перед началом протокола производства лентивирусных векторов CTS.

Мы пробовали другие среды и наблюдали снижение производительности. Для максимального выхода лентивирусного вектора мы рекомендуем использовать CTS LV-MAX Production Medium.

Набор CTS LV-MAX Transfection Kit специально разработан для синергетической работы со средой CTS LV-MAX Production Medium и клетками CTS Viral Production Cells для обеспечения максимального титра лентивирусных частиц. Не рекомендуется смешивать и сочетать реагенты, так как это снизит общую производительность.

Набор для трансфекции CTS LV-MAX содержит три компонента: трансфекционный реагент, добавку и усилитель, которые не продаются по отдельности. Компоненты системы были специально оптимизированы для совместной работы как единая система для получения максимального титра лентивируса. Однако мы можем настроить различные соотношения трансфекционного реагента, добавки и усилителя - для получения дополнительной информации отправьте электронное письмо по адресу customorders@thermofisher.com.

Мы можем предоставить рекомендации по протоколу обнаружения компонентов трансфекционного реагента в рамках CDA. Пожалуйста, свяжитесь с нами по адресу outlicensing@thermofisher.com для получения информации.

Для последующей очистки лентивируса в бессывороточных условиях мы рекомендуем использовать тангенциальную потоковую фильтрацию. Чтобы сохранить целостность лентивирусных векторов, мы не рекомендуем использовать ультрацентрифугирование в бессывороточных условиях.

Предполагаемое использование, валидация и оптимизация протокола различаются между разными типами клеток. Клетки Expi293F и FreeStyle 293-F были специально разработаны и валидированы для временной наработки белка, в то время как клетки для производства вирусных векторов и клетки CTS для производства вирусных векторов были разработаны и валидированы для производства лентивирусных векторов. Общим между клетками Expi293F, клетками для производства вирусных векторов и клетками CTS для производства вирусных векторов является то, что они изначально произошли от линии FreeStyle 293-F. Как клетки Expi293F, так и Freestyle 293F поставляются с нормативной поддержкой, предназначенной для биопроизводственных применений, тогда как клетки CTS для производства вирусных векторов (банк cGMP) предназначены для клеточной и генной терапии и дополнены более надежным пакетом нормативной поддержки для обеспечения клинического применения генной терапии. Это означает, что, насколько это в наших силах, мы поддерживаем наши спецификации продуктов CTS и требования к выпуску в актуальном состоянии в соответствии с последними нормативными указаниями, касающимися этого предполагаемого использования.

Мы предоставляем обширную документацию, подтверждающую историю происхождения, вирусную безопасность и отслеживаемость нашего GMP-производства. В рамках соглашения о конфиденциальности (CDA) мы можем предоставить Сертификат Анализа и Содержание документации. Полный доступ к пакету документации можно получить, обратившись по адресу outlicensing@thermofisher.com.

Пожалуйста, обратитесь к нашим стандартным условиям продажи и лицензионному соглашению об ограниченном использовании. Для получения дополнительной информации, пожалуйста, отправьте электронное письмо по адресу outlicensing@thermofisher.com.