AlgiMatrix™ 24-луночный планшет для 3D-культивирования, плоскодонный микропланшет, 4 x 24 луночных планшета

AlgiMatrix Matrix стабилен в течение 12 месяцев в неоткрытом виде. После открытия всю планшету необходимо использовать.

Помимо реагента для определения жизнеспособности клеток Invitrogen alamarBlue, матрица AlgiMatrix также совместима с реагентом для определения жизнеспособности клеток Invitrogen PrestoBlue и анализом пролиферации клеток Invitrogen CyQuant Direct. Протокол почти такой же, как и для 2D-культуры клеток, но требуется пустая матрица AlgiMatrix в качестве контроля.

Укрепляющий буфер работает за счет добавления кальция в губку, делая ее более жесткой. Растворяющий буфер работает за счет удаления кальция из губки, делая ее более мягкой.

3D клеточная культура с AlgiMatrix Matrix приближается к более физиологическому состоянию с точки зрения роста и поведения клеток, но вместе с этим приходит и более высокая вариабельность, обычно связанная с более сложными системами. Возможно, вам потребуется больше повторов или больше контролей.

Некоторым первичным клеткам (за исключением стволовых клеток) для размножения необходимо прикрепляться. Поскольку клетки не прикрепляются к AlgiMatrix Matrix, эти клетки все еще можно культивировать, но они будут скорее дифференцироваться, чем размножаться. Мы рекомендуем высевать первичные клетки с высокой плотностью.

Высота сухой губки составляет ~3-4 мм. При увлажнении объем губки практически не меняется - она не набухает и не увеличивается в размере, фактически она становится немного меньше, так как по сути возвращается к консистенции гидрогеля, особенно если инокулированные губки кратковременно центрифугируют (как предлагается, чтобы лучше внедрить клетки внутрь, а также равномерно распределить губку по дну лунки).

Альгинат, из которого сделан AlgiMatrix Matrix, представляет собой очень гидрофильную поверхность, к которой не прилипают липидсодержащие клеточные мембраны и даже молекулы. Нормальные клетки будут агрегировать, образуя сфероиды и дифференцироваться в структуры в AlgiMatrix Matrix, но расширение будет ограничено, поскольку большинству нормальных клеток необходимо прикрепление для увеличения численности. Раковые клетки способны расширяться без прикрепления и делают это в AlgiMatrix Matrix (одним исключением являются эмбриональные стволовые клетки, которые могут расширяться как эмбриоидные тела в AlgiMatrix Matrix).

Однако есть одно существенное различие между мягким агаром и AlgiMatrix Matrix: мягкий агар – это гидрогель, а AlgiMatrix Matrix – губка с относительно большими размерами пор, и клетки, которые растут, смогут делать это легче и быстрее в AlgiMatrix Matrix, чем будучи заключенными в гидрогель (мягкий агар). Таким образом, традиционный способ отличить раковые клетки от нормальных – наблюдать за культурой на предмет расширения; раковые клетки (например, гепатокарцинома HepG2) будут формировать расширяющиеся сфероиды, в то время как нормальные клетки будут формировать сфероиды, которые не увеличиваются в размере или количестве.

Современные, более высокоочищенные формы альгината не вызывают реакции чувствительности, в отличие от менее чистых версий. Альгинат уже несколько лет используется для инкапсуляции, например, B-клеток поджелудочной железы для in vivo трансплантации (исследования диабета), и он не отторгается.

Наш поставщик уже много лет производит альгинат и гиалуроновую кислоту фармацевтического класса. Несмотря на то, что это натуральные продукты, благодаря, среди прочего, спецификации (в случае альгината) места сбора, температуры воды, того, какую часть водорослей собирать, использованию строгих стандартных операционных процедур очистки и строгим критериям контроля качества, можно получить очень стандартный продукт.

Исследования инвазии измеряют способность клеток проникать через матрикс, имитируя активность метастатических клеток in vivo. AlgiMatrix Matrix содержит только альгинат (бурые водоросли) без in vivo-подобных молекул в недекорированной структуре, поэтому изучение инвазии может быть не очень актуальным применением для AlgiMatrix Matrix.

Стандартное иммунофлуоресцентное тестирование можно проводить на 3D структурах. Окрашивание можно проводить либо с интактными сфероидами внутри AlgiMatrix Matrix, либо вы можете растворить AlgiMatrix Matrix с помощью Versene или 55 мМ три-натрий цитрата дигидрата и окрашивать сфероид отдельно. Вы можете дополнительно диссоциировать сфероид на отдельные клетки с помощью реагента TrypLE и окрашивать в виде диссоциированных клеток.

Geltrex Matrix — это экстракт базальной мембраны, который содержит коллаген IV, ламинин и другие матриксные белки и факторы роста, необходимые для адгезии клеток. AlgiMatrix Matrix содержит только альгинат, который не способствует адгезии клеток. В альгинатных губках нет ничего, с чем могли бы взаимодействовать клетки.

Для стволовых клеток пуповинной крови вы можете попробовать относительно высокую плотность инокуляции - 100 000 - 300 000 клеток на губку, с ежедневной или через день заменой питательной среды, так как среда становится “желтой”.

Этот каркас отлично подходит для формирования трехмерных сфероидов, которые обеспечивают максимальное взаимодействие клеток друг с другом. Установившиеся клеточные линии расширяются за счет увеличения размера сфероидов примерно до 100 клеток или около того, в зависимости от типа клеток. Как первичные, так и установившиеся клетки будут дифференцироваться в трехмерном формате в течение 1-2 недель культивирования.

Пожалуйста, ознакомьтесь со следующими ссылками, специально для стволовых клеток:

- Methods Enzymol 420:303 (2006)
- Biotechnol Bioeng 88:313 (2004)

Фоновое окрашивание с альгинатом практически отсутствует. Та же самая характеристика поверхности, которая препятствует прилипанию клеток, также значительно затрудняет прилипание молекул, таких как флуоресцеинированные антитела, поэтому, по сути, фоновое окрашивание не наблюдается.

Хотя мы не тестировали это у себя, обычно считается, что если альгинатные каркасы поддерживают пролиферацию клеток ES человека без фидерных клеток, они также должны поддерживать клетки ES мыши. И мышиные, и человеческие клетки формируют эмбриоидные тела, и посев в макропористые альгинатные каркасы оказался очень полезным для этих структур с точки зрения пролиферации и дифференцировки.

Gibco Geltrex Matrix и коллаген (крысиный хвост и бычий) можно использовать как в качестве раствора для покрытия, так и в качестве трехмерного гелевого матрикса. CELLstart Substrate был разработан для использования в качестве ксеногенной подложки только для ESC приложений (в качестве заменителя Gibco Geltrex Matrix или Matrigel Matrix, которые имеют животное происхождение). AlgiMatrix Matrix представляет собой трехмерный матрикс каркасного типа, который не поддерживает прикрепление клеток, но обеспечивает хорошую среду для выращивания сфероидов, которые можно легко собрать для последующих применений.

Да, начните с растворения матрикса с использованием раствора, связывающего кальций, Версена или цитрата натрия. Оставшиеся сфероиды можно диссоциировать с помощью реагента TrypLE, подсчитать и размножить в других культуральных сосудах или в новых губках AlgiMatrix Matrix. Эти шаги проиллюстрированы в руководстве по эксплуатации, которое поставляется с каждым набором.

Формирование сфероидов занимает примерно от 5 до 7 дней после инокуляции. Во время инокуляции будут наблюдаться пузырьки воздуха. Они рассеются в течение нескольких дней, когда клетки потребят кислород.

Добавляйте среду аккуратно, под углом. Будьте осторожны, чтобы не повредить матрикс при повторном кормлении.

Мы показали следующие данные:

- Фокусировка на клетках в культуре демонстрирует признаки инокуляции.
- Заливка в парафин и изготовление срезов показывают, что клетки инокулированы по всему объему губки.