293fectin™ Transfection Reagent 15 mL

Реагент FreeStyle Max и трансфекционный реагент 293fectin обеспечивают схожий уровень высокой эффективности трансфекции; однако реагент FreeStyle Max обладает меньшей цитотоксичностью и, следовательно, приводит к более высоким выходам белка. Кроме того, реагент FreeStyle Max не содержит компонентов животного происхождения.

Мы рекомендуем вам попробовать электропорацию в качестве метода доставки вашей интересующей плазмиды. Мы предлагаем систему трансфекции Neon для высокоэффективной трансфекции первичных клеток, стволовых клеток и трудно трансфицируемых клеток.Вы также можете рассмотреть возможность использования вирусной системы для доставки вашего гена в интересующую вас линию клеток млекопитающих.

Да, все наши липидные реагенты для трансфекции стабильны при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.

Кривая «доза-ответ» — ценный инструмент для определения токсичности для клеток при воздействии различных концентраций антибиотика. Количество селективного антибиотика, необходимого для отбора резистентных клеток, варьируется в зависимости от ряда факторов, включая тип клеток и тип антибиотика. Мы рекомендуем строить кривую «доза-ответ» каждый раз, когда используется новый антибиотик (или другой бренд) или другая клеточная линия.

Экспериментальная схема анализа кривой «доза-ответ»:

1. Поместите клетки в несколько лунок так, чтобы они были сливными на 25–30%. Это означает, что клетки все еще делятся и, следовательно, хорошо реагируют на антибиотик.
2. Разведите тестируемый антибиотик до широкой линейной концентрации рекомендованного диапазона в среде для роста.
3. Удалите среду для роста из клеток. Нанесите среду, содержащую антибиотик, в соответствующие лунки, оставив один набор лунок пустым. В эти лунки добавьте среду для роста, не содержащую антибиотик.
4. Культивируйте клетки в надлежащих условиях роста (меняйте среду каждые 3–4 дня, чтобы избавиться от мертвых клеток и добавьте свежую среду, содержащую антибиотик) и ежедневно наблюдайте за клетками. Через 10–14 дней оцените количество жизнеспособных клеток в каждой лунке. (Этот период времени зависит от тестируемого антибиотика; для таких антибиотиков, как генетицин, гигромицин и зеоцин, требуется около 3 недель, чтобы убить клетки, поэтому ожидание в течение 10–14 дней было бы идеальным. Однако для бластицидина, который убивает клетки примерно за 2 недели, ожидания в течение 7–10 дней будет достаточно.) Для этого отберите среду, промойте клетки фосфатно-солевым буфером и окрасьте клетки 0,5% метиленовым синим и 50% метанолом в течение 20 минут.
5. Постройте график зависимости количества жизнеспособных клеток от концентрации антибиотика. Эта кривая представляет собой кривую «доза-ответ» или кривую гибели клеток. Самая низкая концентрация антибиотика, которая убивает все клетки за выбранный период времени, затем используется для стабильного отбора.

Трансфекция не работает с некоторыми типами клеток, такими как неделящиеся клетки, тогда как вирусная трансдукция работает как с делящимися, так и с неделящимися клетками, такими как нейрональные клетки, которые трудно трансфицировать.

Основное преимущество липид-опосредованной трансфекции заключается в более высокой эффективности трансфекции, которую можно достичь с типами клеток, которые не могут быть трансфицированы с использованием фосфата кальция. Фосфат кальция подвержен вариабельности из-за его чувствительности к незначительным изменениям pH, температуры и концентрации солей в буфере. Фосфат кальция также может быть цитотоксичен для многих типов клеток, особенно для первичных клеток. Кроме того, липид-опосредованная трансфекция может использоваться для доставки ДНК в диапазоне от олигомеров до крупной ДНК, а также может доставлять РНК и белок.

Во время транзиторной трансфекции экзогенная ДНК не интегрируется в геном клетки-хозяина, в результате чего часть ДНК теряется при каждом последующем делении клетки. Экспрессия кратковременна (максимум 7-10 дней), но уровень экспрессии высок, поскольку в клетку может быть доставлено до сотен копий ДНК. При стабильной трансфекции, под давлением антибиотической селекции, ДНК интегрируется в геном клетки-хозяина и передается ее дочерним клеткам во время деления клетки. Таким образом, экспрессия поддерживается до тех пор, пока сохраняется давление селекции. Уровень экспрессии низок, поскольку на клетку может быть интегрировано только 1-2 копии ДНК. Эффективность трансфекции при стабильной трансфекции составляет примерно 1-10% от эффективности при транзиторной трансфекции.

1 единица A260 (двухцепочечная ДНК в H2O) = 50 мкг/мл. Коэффициент экстинкции изменится, если ДНК разбавлена в буфере, отличном от H2O. Это изменит значение, указанное выше.

Пример расчета:

Объем образца плазмидной ДНК = 100 мкл

Разведение (1/20) = 25 мкл образца в 475 мкл H2O

A260 разбавленного образца = 0.65

Примечание: Для оптимальных результатов убедитесь, что значения OD находятся в пределах 0.1 и 1.0.

Концентрация образца плазмидной ДНК = 0.65 x 50 мкг/мл x 20 (фактор разведения) = 650 мкг/мл

Количество плазмидной ДНК в образце = 650 мкг/мл x 0.1 мл (объем образца) = 65 мкг

Значение A260/A280 в диапазоне от 1.8 до 2.0 означает, что плазмидная ДНК чиста. Показания A260/A280 менее 1.8 указывают на то, что образец может быть загрязнен ароматическими продуктами (например, фенолом) или белком. Показатели выше 2.0 предполагают, что образец загрязнен РНК.

При прямой трансфекции клетки засевают в лунки или чашки до необходимой конфлюентности или плотности, а липидно-ДНК комплексы добавляют на следующий день. При обратной трансфекции комплексы для трансфекции готовят непосредственно в лунках, после чего добавляют клетки и среду. Обратную трансфекцию выполнять быстрее, чем прямую, и это предпочтительный метод для высокопроизводительной трансфекции. Для трансфекций, не требующих высокой пропускной способности, прямая трансфекция обычно обеспечивает лучшую эффективность для большинства типов клеток.

Нет. Эффективность трансфекции в значительной степени зависит от количества реагента, используемого на лунку, и может различаться для разных реагентов. Пожалуйста, обратитесь к информации о продукте, которая поставляется с трансфекционным реагентом, для оптимального использования.

Протокол, поставляемый с продуктом, предоставит вам оптимальный диапазон трансфекционного реагента для использования на лунку. Во время разработки продукта было установлено, что этот диапазон хорошо работает с различными клеточными линиями. Если вы все еще не достигаете желаемых результатов в вашей конкретной клеточной линии, может потребоваться дополнительная оптимизация.

Посетите страницу продукта для каждого типа реагента, и внизу страницы вы увидите список ссылок. Также доступна таблица, в которой перечислены конкретные ссылки на клеточные линии. Мы также рекомендуем www.highwire.org в качестве поисковой системы для поиска большого количества современных исследовательских статей, в которых используются наши продукты для трансфекции. Просто включите название трансфекционного реагента и интересующую вас клеточную линию/применение в критерии поиска.

Выберите лучший реагент в зависимости от типа клеток и применения, используя руководство по выбору трансфекционного реагента.

Существует множество методов трансфекции для доставки плазмид, фрагментов ДНК, олигонуклеотидов, siRNAs, мРНК или белков для широкого спектра исследований и разработок лекарственных препаратов. Обзор преимуществ и недостатков каждого метода можно найти здесь.

Антибиотики можно использовать в среде для культивирования клеточных линий. Однако мы не рекомендуем использовать антибиотики в среде для трансфекции, если это предварительно не было протестировано на данном типе клеток и переносимом материале. Это связано с тем, что присутствие антибиотиков во время трансфекции может негативно повлиять на эффективность трансфекции (например, положительно заряженные антибиотики связываются с трансфицируемой ДНК) и общее состояние трансфицируемых клеток.

Нет необходимости использовать среду, не содержащую сыворотку, во время липидной трансфекции. Однако крайне важно формировать комплекс липид:нуклеиновая кислота в отсутствие сыворотки, поскольку белки могут препятствовать формированию комплекса. После того, как комплексы сформированы, их можно добавлять к клеткам в среде, содержащей сыворотку. Для достижения оптимальных результатов с реагентом для трансфекции Lipofectin мы рекомендуем проводить трансфекцию в среде без сыворотки.

Полипропиленовые, полистироловые или стеклянные пробирки можно использовать с любым из наших продуктов для трансфекции без каких-либо проблем.

Мы рекомендуем использовать реагент Lipofectamine 3000 для доставки плазмидной ДНК, реагент Lipofectamine MessengerMAX для мРНК или коротких олигонуклеотидов и реагент Lipofectamine RNAiMAX для siRNA или miRNA. Пожалуйста, обратитесь к руководству по выбору трансфекционного реагента, чтобы выбрать лучший реагент на основе типа клеток и применения.

Чтобы обеспечить оптимальный успех трансфекции, мы рекомендуем включить положительный контроль трансфекции и дополнительные контрольные образцы для подтверждения здоровья клеток и качества реагентов.

Для трансфекции ДНК мы рекомендуем использовать pJTI R4 Exp CMV EmGFP pA Vector (Cat. No. A14146). Для трансфекции siRNA мы рекомендуем использовать BLOCK-iT AlexaFluor Red Fluorescent Control (Cat. No. 14750100) или Silencer Select GAPDH Positive Control siRNA (Cat. No. 4390850). Для трансфекции белков мы рекомендуем совместно трансфицировать с мРНК EmGFP, такой как Tri-Link CleanCap EGFP mRNA (Cat. No. L-7201).

Контрольные образцы для здоровья клеток и качества реагентов:
- Только клетки
- Клетки + только ДНК, РНК или белок
- Клетки + только липидный реагент
- Клетки + только Opti-MEM
- Клетки + положительный контроль

Вот некоторые моменты, которые следует учитывать:

1. Выберите липидный реагент, который с наибольшей вероятностью приведет к наивысшей эффективности трансфекции для вашего типа клеток, полезной нагрузки и применения.
2. Оптимизируйте количество как липидного реагента, так и ДНК. Самым важным параметром после состояния клеток является соотношение липида к ДНК.
3. Не используйте сыворотку во время образования комплексов. Сыворотка может содержать компоненты, которые могут помешать образованию комплексов. Мы рекомендуем использовать среду Opti-MEM I Reduced-Serum Medium для оптимального образования комплексов. Однако можно использовать DMEM без сыворотки или RPMI 1640 Medium без сыворотки, но эффективность образования комплексов может быть не такой высокой, как при использовании Opti-MEM I Reduced-Serum Medium.
4. Не используйте антибиотики, ЭДТА, цитрат, фосфат, хондроитинсульфат, гиалуроновую кислоту, декстрансульфат или другие сульфатированные протеогликаны в среде, используемой для приготовления комплексов ДНК-катионный липидный реагент.
5. Плотность клеток должна составлять от 50% до 80% конфлюэнтности во время трансфекции (пожалуйста, обратитесь к руководству по конкретному реагенту для получения подробной информации). Клетки должны находиться в середине логарифмической фазы роста. Для лучшей согласованности и воспроизводимости результатов между экспериментами по трансфекции точно подсчитайте свои клетки с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток Countess II FL (Cat. No. AMQAF1000).
6. Убедитесь, что промотор и/или энхансер (любые регуляторные последовательности гена) трансфицированной ДНК совместимы с целевым типом клеток.
7. Не используйте катионный липидный реагент, который был заморожен или хранился при температуре ниже 4 градусов C.
8. Включите положительный контроль для анализа трансфекции (например, Cat. No. A14146 для трансфекции плазмидной ДНК и Cat. No. 14750100 для трансфекции siRNA).

Для дополнительных советов, пожалуйста, просмотрите советы, изложенные здесь.

Наши реагенты для трансфекции поставляются при комнатной температуре и должны быть немедленно помещены на хранение при температуре 4°C после получения. Мы гарантируем эффективность продукта, при условии правильного хранения и обращения, в течение одного года с даты отправки, если иное не указано на этикетке пробирки или в сертификате анализа. Мы не рекомендуем замораживать реагенты для трансфекции, так как это обычно снижает эффективность трансфекции.

Пожалуйста, ознакомьтесь с этим техническим документом об отгрузке реагентов для трансфекции Lipofectamine при комнатной температуре.

Вполне нормально видеть некоторый осадок на клетках. Однако, распространенной причиной обнаружения необычно большого количества осадка на клетках после трансфекции на основе липидов является избыток ЭДТА или катионных липидов. Мы рекомендуем разбавлять ДНК в воде или, если предпочтительнее использовать ТЕ, использовать концентрации ЭДТА <0,3 мМ. Также убедитесь, что концентрации катионных липидных реагентов не превышают рекомендованные количества во время образования комплекса. Наличие или отсутствие этого осадка не является показателем эффективности трансфекции.

Ниже приведены возможные причины снижения жизнеспособности после трансфекции, а также предлагаемые решения.

1. Возможная причина: Неоптимальное соотношение ДНК:трансфекционный реагент для данной клеточной линии
   Предлагаемое решение: Приготовьте комплексы, используя соотношение ДНК (мкг) к Lipofectamine 2000 (мкл) от 1:2 до 1:3 для большинства клеточных линий. Может потребоваться оптимизация. В этом случае изменяйте соотношение ДНК (мкг): Lipofectamine 2000 (мкл) от 1:0,5 до 1:5.
2. Возможная причина: Препарат плазмидной ДНК содержит высокий уровень эндотоксинов
   Предлагаемое решение: Убедитесь, что плазмидная ДНК или siRNA, используемые для трансфекции, имеют высокое качество. Для наборов для очистки плазмидной ДНК мы рекомендуем использовать наши наборы для очистки нуклеиновых кислот PureLink HiPure.
3. Возможная причина: Плотность клеток была неоптимальной
   Предлагаемое решение: Lipofectamine 2000 лучше всего работает в культурах, которые >90% на момент трансфекции.
4. Возможная причина: Комплексы добавлялись к клеткам в среде без сыворотки
   Предлагаемое решение: Попробуйте использовать среду для роста, содержащую сыворотку, при проведении трансфекций. Производительность трансфекции обычно выше, когда клетки более жизнеспособны. Если вам требуются условия без сыворотки, проверьте среду на совместимость с Lipofectamine 2000, поскольку некоторые составы без сыворотки (например, CD293, SFM II, VP-SFM) могут ингибировать трансфекцию, опосредованную катионными липидами.
5. Возможная причина: Комплексы недостаточно тщательно перемешаны в среде для роста
   Предлагаемое решение: После добавления трансфекционных комплексов в среду убедитесь, что планшет или лунки тщательно перемешаны, чтобы предотвратить концентрацию комплексов ДНК:трансфекционный реагент в лунках
6. Возможная причина: Клетки изменились со временем, или изменились условия рассева
   Предлагаемое решение: Если производительность трансфекции внезапно снижается, это может быть связано с клетками. Мы рекомендуем рассевать и высевать клетки по постоянному графику и таким образом, чтобы клетки никогда не были слишком редкими или слишком плотными. Чрезмерное пассирование также снижает производительность трансфекции. В этом случае начните новую пробирку с клетками из жидкого азота.
7. Возможная причина: В среде для роста во время трансфекции использовались антибактериальные средства
   Предлагаемое решение: Не используйте антибиотики, такие как хлорохин, пенициллин или стрептомицин, в среде для роста, поскольку во время трансфекции клетки более проницаемы для антибиотиков, что может вызвать токсичность.
8. Возможная причина: Трансфекционный реагент хранился неправильно
   Предлагаемое решение: Мы рекомендуем хранить трансфекционные реагенты при 4°C. Замораживание трансфекционных реагентов или хранение их при комнатной температуре может снизить активность.
9. Возможная причина: Катионный липидный реагент был окислен
   Предлагаемое решение: Не перемешивайте и не взбалтывайте катионные липидные реагенты чрезмерно; это может привести к образованию пероксидов катионных липидных реагентов.
10. Возможная причина: Антибиотик для селекции добавлен слишком рано
    Предлагаемое решение: При создании стабильных клеточных линий дайте клеткам не менее 72 часов для экспрессии гена устойчивости перед добавлением селективного антибиотика.

Ниже приведены возможные причины низкой эффективности трансфекции, а также предлагаемые решения:

1. Возможная причина: Плазмидная ДНК, siRNA или реагент для трансфекции разбавлены в среде, содержащей сыворотку, или комплексы образовались в присутствии сыворотки
   Предлагаемое решение: Используйте бессывороточную среду для разбавления плазмидной ДНК, siRNA и реагентов для трансфекции. Примечание: мы рекомендуем использовать Opti-MEM | Reduced Serum Medium (Cat. No. 31985-062) для разбавления Lipofectamine 2000 и ДНК перед комплексообразованием.
2. Возможная причина: Отношение ДНК:реагент для трансфекции не оптимально для клеточной линии
   Предлагаемое решение: Подготовьте комплексы, используя отношение ДНК (µг) к Lipofectamine 2000 (µL) от 1:2 до 1:3 для большинства клеточных линий. Может потребоваться оптимизация. Если это так, варьируйте соотношения ДНК (µг): Lipofectamine2000 (µL) от 1:0,5 до 1:5. Если вы используете другой реагент для трансфекции, пожалуйста, обратитесь к инструкции к продукту.
3. Возможная причина: Недостаточно плазмидной ДНК, используемой для разбавления или образования комплекса
   Предлагаемое решение: Проверьте концентрацию, используя второй метод, или проверьте ДНК на деградацию. Определите концентрацию ДНК, выполнив измерения A260/A280 на спектрофотометре или с помощью наборов Quant-iT DNA Assays Kits (Q33130, Q33120).
4. Возможная причина: Плазмидная ДНК или siRNA, используемая в трансфекции, деградировала или имеет низкое качество
   Предлагаемое решение: Убедитесь, что плазмидная ДНК или siRNA, используемая для трансфекции, имеет высокое качество. Для наборов для очистки плазмидной ДНК мы рекомендуем использовать наши PureLink HiPure Nucleic Acid Purification Kits.
5. Возможная причина: Плотность клеток не была оптимальной
   Предлагаемое решение: Lipofectamine 2000 лучше всего работает в культурах, которые >90% на момент трансфекции.
6. Возможная причина: Комплексы были добавлены к клеткам в бессывороточной среде
   Предлагаемое решение: Попробуйте использовать ростовую среду, содержащую сыворотку, при проведении трансфекций. Эффективность трансфекции обычно выше, когда клетки более жизнеспособны. Если вам требуются бессывороточные условия, проверьте совместимость среды с Lipofectamine 2000, поскольку некоторые бессывороточные составы (например, CD293, SFM II, VP-SFM) могут ингибировать трансфекцию, опосредованную катионными липидами.
7. Возможная причина: В среде присутствовали ингибиторы
   Предлагаемое решение: Не используйте антибиотики, ЭДТА, цитрат, фосфат, RPMI, хондроитинсульфат, гиалуроновую кислоту, декстрансульфат или другие сульфатированные протеогликаны в ростовой среде или в среде, используемой для приготовления комплексов ДНК:реагент для трансфекции.
8. Возможная причина: Проблемы с анализом, используемым для измерения эффективности или экспрессии
   Предлагаемое решение: Используйте репортерный ген для измерения эффективности трансфекции. Контроль репортерного гена позволяет подтвердить экспрессию.
9. Возможная причина: Промотор-энхансер на векторе не распознается типом клеток
   Предлагаемое решение: Убедитесь, что промотор-энхансер на вашей векторной конструкции совместим с целевым типом клеток.
10. Возможная причина: Клетки изменились со временем, или условия расщепления изменились
    Предлагаемое решение: Если эффективность трансфекции внезапно снижается, это может быть связано с клетками. Мы рекомендуем расщеплять и высевать клетки по последовательному графику и таким образом, чтобы клетки никогда не были слишком разреженными или слишком плотными. Чрезмерное пассирование также снижает эффективность трансфекции. Если это так, начните новую пробирку с клетками из жидкого азота.
11. Возможная причина: Реагент для трансфекции хранился неправильно
    Предлагаемое решение: Мы рекомендуем хранить реагенты для трансфекции при 4°C. Замораживание реагентов для трансфекции или хранение их при комнатной температуре может снизить активность.

Для плазмидной ДНК, пригодной для трансфекции, используйте набор для очистки плазмид PureLink HiPure или PureLink Expi, обеспечивающий чистоту плазмиды, эквивалентную 2-кратному градиенту CsCl. Для ДНК без эндотоксинов (< 9,1 EU/мкг) используйте набор PureLink Expi Endotoxin-Free Kit (Maxi, Mega или Giga). ДНК без эндотоксинов рекомендуется для чувствительных применений, таких как трансфекция первичных клеток и исследования генной терапии для плазмидных вакцин. Для получения дополнительной информации, пожалуйста, нажмите здесь:

Наши катионные липидные реагенты для трансфекции используются для трансфекции ДНК (плазмид или олигонуклеотидов), siRNA (или miRNA), мРНК или белков. Доставляемая ДНК может быть в форме плазмид, космид или даже YAC-клонов размером до 600 Kb.

Да. Можно следовать стандартному протоколу трансфекции, поддерживая общее количество ДНК в смеси постоянным. То есть, если ваш протокол требует 1 мкг плазмиды, используйте 0,5 мкг каждой из двух котрансфектированных плазмид или 0,25 мкг каждой из 4 котрансфектированных плазмид. При выполнении котрансфекций для введения селективного маркера на другой плазмиде мы рекомендуем использовать 3:1 - 10:1 молярный избыток интересующей плазмиды над селективной плазмидой, чтобы гарантировать, что интересующая плазмида присутствует вместе с селективной плазмидой.

Посетите страницу продукта для каждого типа реагента, и вы увидите список ссылок внизу страницы. Также доступна таблица, в которой перечислены конкретные ссылки на клеточные линии. Мы также рекомендуем www.highwire.org в качестве поисковой системы для поиска большого количества актуальных исследовательских статей, использующих наши продукты для трансфекции. Просто включите название реагента для трансфекции и интересующую вас клеточную линию/применение в критерии поиска.

Протоколы трансфекции, специфичные для клеточной линии, можно найти здесь (ссылка удалена). Если вы не найдете протокол, специфичный для клеточной линии, или если трансфекция не выполняется должным образом, мы рекомендуем оптимизировать условия, описанные в руководстве по продукту. Успешная трансфекция зависит от типа клеток, количества липидов, состояния клеток, номера пассажа и плотности клеток во время трансфекции. Каждый из этих факторов может незначительно отличаться от лаборатории к лаборатории и может потребовать дополнительной оптимизации протокола для достижения одинакового результата. Пожалуйста, просмотрите наши полезные советы по устранению неполадок: (ссылка удалена). Для получения дополнительных советов по устранению неполадок посетите наш Центр поддержки трансфекции (ссылка удалена).

Экспрессия во временно трансфицированных клонах обычно выше, потому что временно трансфицированные клетки могут иметь до сотен копий плазмиды, содержащей интересующий ген. Стабильно трансфицированные клоны обычно содержат 1-2 копии, интегрированные в геном, и, следовательно, имеют более низкий уровень экспрессии. Иногда более низкий уровень экспрессии в стабильно трансфицированных клетках обусловлен неблагоприятным воздействием рекомбинантного белка на клетку при конститутивной экспрессии.

В целом, эффективность трансфекции будет демонстрировать некоторую степень изменчивости между экспериментами по трансфекции и между повторностями в одном и том же эксперименте по трансфекции. Для лучшей воспроизводимости, поддерживайте все параметры трансфекции, такие как конфлюэнтность клеток, номер пассажа и фаза роста, постоянными между трансфекциями. Если возможно, размораживайте свежие клетки. Мы рекомендуем приготовить один мастер-микс ДНК/липидных комплексов для запланированного количества трансфекций, чтобы уменьшить количество ошибок при многократном пипетировании. При добавлении комплексов мы рекомендуем менять наконечники между лунками, поскольку повторно использованные наконечники могут привести к переносу, особенно для 96- или 384-луночного формата с малым объемом. Чтобы еще больше минимизировать влияние изменчивости трансфекции на анализ данных, рассмотрите возможность котрансфекции внутреннего референсного контрольного образца нормализации, такого как бета-галактозидаза или люцифераза, с экспрессионной плазмидой. Ниже приведены возможные причины, по которым результаты трансфекции не воспроизводятся, а также предлагаемые решения:

1. Возможная причина: Клетки изменились со временем, или условия расщепления изменились
   Предлагаемое решение: Если эффективность трансфекции внезапно снижается, это может быть из-за клеток. Мы рекомендуем расщеплять и высевать клетки по согласованному графику и таким образом, чтобы клетки никогда не были слишком редкими или слишком плотными. Чрезмерное пассирование также снижает эффективность трансфекции. Если это так, начните новую пробирку с клетками из жидкого азота.
2. Возможная причина: Трансфекции выполнялись при разной конфлюэнтности клеток или при разных соотношениях ДНК:трансфекционный реагент
   Предлагаемое решение: Воспроизводимость эффективности трансфекции зависит от ежедневной согласованности в расщеплении клеток, посеве и трансфекции с использованием последовательного протокола (одинаковые соотношения ДНК:трансфекционный реагент). Различные препараты ДНК или изменения среды также могут изменить эффективность трансфекции.

В каждом из наших протоколов реагентов для трансфекции есть таблица для масштабирования трансфекций. Пожалуйста, обратитесь к конкретному руководству для получения подробной информации.

Для размеров лунок или планшетов, не указанных в таблице масштабирования, рассчитайте общую площадь поверхности и оцените разницу в количестве раз по сравнению с 24-луночным планшетом. Используйте эту разницу, чтобы скорректировать объемы реагентов, количества полезной нагрузки и плотность посева.

Да, плотность клеток является важным параметром, влияющим на эффективность трансфекции. Если плотность посева слишком низкая, можно наблюдать некоторую цитотоксичность. Если плотность клеток высокая, можно наблюдать более низкую, чем ожидалось, эффективность трансфекции. Обе проблемы можно легко решить, уменьшив или увеличив количество комплексов, добавляемых в культуру. Мы рекомендуем использовать Lipofectamine 3000, поскольку он демонстрирует наилучшую гибкость для переменной плотности посева без проявления проблем цитотоксичности и поддерживает высокую экспрессию белка.

Lipofectamine 3000, Lipofectamine 2000 и Lipofectamine LTX/PLUS обеспечивают отличную эффективность трансфекции при конфлюентности от 70 до 90%. Некоторая токсичность может наблюдаться при более низкой конфлюентности, но ее можно уменьшить, уменьшив количество комплексов или удалив комплексы после 4-6 часов инкубации и обновив среду. Lipofectamine RNAiMAX лучше всего работает при конфлюентности от 60 до 80%.

Номер пассажа может влиять на эксперименты по трансфекции. Мы рекомендуем последовательное расщепление и посев клеток. Чрезмерное количество пассажей может снизить эффективность трансфекции. Мы не рекомендуем расщеплять клетки более чем на 20-30 пассажей. Если эффективность трансфекции снижается, а клетки находятся в культуре в течение длительного времени или подвергались чрезмерному/неправильному пассированию, мы рекомендуем вам перезапустить ваши культуры с новой пробиркой клеток из жидкого азота. Пожалуйста, обратитесь к руководству Gibco Cell Culture Basics (https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html) для получения надлежащих рекомендаций по культивированию и пассированию клеток.