Zeocin™: Антибиотик для селекции клеточных культур

Все наши антибиотики (Генетицин, Zeocin, Гигромицин B, Бластицидин и Пуромицин) можно использовать вместе для создания множественных стабильных клеточных линий. Однако, для каждой комбинации антибиотиков необходимо построить кривые гибели клеток, поскольку чувствительность к определенному антибиотику, как правило, возрастает при его сочетании с другими антибиотиками.

Если незаменимая культура заражена, исследователи могут попытаться устранить или контролировать загрязнение.

1. Определите, является ли загрязнение бактериями, грибками, микоплазмой или дрожжами. Подробнее о характеристиках каждого загрязнителя можно прочитать здесь.
2. Изолируйте зараженную культуру от других клеточных линий.
3. Очистите инкубаторы и ламинарные боксы с помощью лабораторного дезинфицирующего средства и проверьте HEPA-фильтры.
4. Антибиотики и антимикотики в высоких концентрациях могут быть токсичными для некоторых клеточных линий. Поэтому выполните тест доза-ответ, чтобы определить уровень, при котором антибиотик или антимикотик становится токсичным. Это особенно важно при использовании антимикотика, такого как реагент Gibco Fungizone, или антибиотика, такого как тилозин.

Ниже приведена предлагаемая процедура определения уровней токсичности и деконтаминации культур:

1. Диссоциируйте, посчитайте и разбавьте клетки в среде, не содержащей антибиотиков. Разбавьте клетки до концентрации, используемой для регулярного пассажа клеток.
2. Разлейте клеточную суспензию в многолуночный планшет для культивирования или несколько небольших колб. Добавьте выбранный антибиотик в каждую лунку в диапазоне концентраций. Например, мы предлагаем следующие концентрации для реагента Gibco Fungizone: 0,25, 0,50, 1,0, 2,0, 4,0 и 8,0 мкг/мл.
3. Ежедневно наблюдайте за клетками на предмет признаков токсичности, таких как отслоение, появление вакуолей, уменьшение конфлюентности и округление.
4. Когда токсичный уровень антибиотика определен, культивируйте клетки в течение двух-трех пассажей, используя антибиотик в концентрации, в один-два раза меньшей, чем токсичная концентрация.
5. Культивируйте клетки в течение одного пассажа в среде, не содержащей антибиотиков.
6. Повторите шаг 4.
7. Культивируйте клетки в среде, не содержащей антибиотиков, в течение четырех-шести пассажей, чтобы определить, было ли устранено загрязнение.

Для достижения наилучших результатов оптимальные концентрации для селекции следует определять эмпирически в каждом уникальном эксперименте с помощью кривых доза-ответ. Однако, чтобы получить общее представление о концентрациях, которые работали для отдельных типов клеток, введите “Селекционные антибиотики” в наш основной поиск на www.thermofisher.com.

Zeocin – это препарат, содержащий флеомицин D1, основный, водорастворимый гликопептид, хелатированный медью и выделенный из Streptomyces verticillus. Наличие меди придает раствору синий цвет. Эта хелатная форма меди неактивна. Когда антибиотик попадает в клетку, катион меди восстанавливается с Cu2+ до Cu1+ и удаляется сульфгидрильными соединениями в клетке. После удаления меди Zeocin активируется и связывается с ДНК, расщепляя ее, что приводит к гибели клеток.

Пожалуйста, просмотрите следующую страницу, чтобы ознакомиться с предлагаемыми нами антибиотиками для клеточных культур.

MW=1,535. Молекулярная формула: C60H89N21O21S3.

Бластицидин: Нуклеозид. Ингибирует синтез белка в прокариотических и эукариотических клетках, вмешиваясь в пептидилтрансферазную реакцию синтеза белка, вызывая преждевременное завершение трансляции.

Генетицин (G418): Аминогликозид. Блокирует синтез белка в клетках млекопитающих, вмешиваясь в рибосомальную функцию.

Гигромицин: Аминоциклитол. Ингибирует синтез белка, нарушая транслокацию и способствуя ошибочной трансляции.

Зеоцин: Интеркалирует с ДНК и расщепляет ее.

Zeocin в среде или другой жидкой форме представляет опасность для здоровья при попадании на кожу или при проглатывании. В порошкообразной твердой форме он может представлять опасность для дыхательных путей, а также при контакте и проглатывании. Если жидкость или среду поместить в автоклавируемый пакет, ее можно автоклавировать. Повышенные температуры внутри автоклава инактивируют Zeocin. Гипохлорит натрия (отбеливатель) также инактивирует Zeocin. Мы настоятельно рекомендуем носить соответствующие средства индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и защиту для глаз) при работе с Zeocin.

Это правда, что процент нерезистентных клеток млекопитающих не округляется и не открепляется от планшета при селекции Зеоцином, как это можно было бы наблюдать при селекции G418 или Гигромицином. Однако, следует наблюдать очень характерные морфологические изменения, происходящие в тех клетках, которые не являются резистентными. Эти клетки, которые прилипают к культуральному планшету, обычно демонстрируют огромное увеличение размера. Это можно лучше всего описать как похожее на воздействие цитомегаловируса, инфицирующего пермиссивные клетки. Форма этих клеток также может измениться, приобретая «инопланетную» форму. При внимательном изучении нерезистентных клеток исследователь должен наблюдать отчетливое разрушение как ядерной, так и плазматической мембран. Даже если «клетки» все еще прикреплены к планшету, у них должен быть вид множества отверстий в этих мембранах. Кроме того, до разрушения мембран можно наблюдать открытые участки в цитоплазме клеток, которые выглядят как большие пустые везикулы. Хотя это и не подтверждено, это можно объяснить разрушением эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи или других каркасных белков. В конце концов, эти «клетки» полностью разрушатся, так что останутся только «нити» белка.

В отличие от этого, клетки, резистентные к Зеоцину, должны продолжать делиться через регулярные промежутки времени, образуя отчетливые скопления клеток или колонии. Не должно быть явных изменений в морфологии, которые можно сравнить с клетками, не находящимися под селекцией с Зеоцином. Именно эти колонии активно делящихся клеток содержат ген резистентности и активно его экспрессируют.

Если есть опасения по поводу прилипания мертвых клеток к планшету, можно сделать следующее, чтобы удалить их: Обработайте планшет в течение пары минут трипсином/версеном. И здоровые резистентные клетки, и мертвые клетки оторвутся от планшета. Затем клетки можно повторно высеять (без селекции Зеоцином), и здоровые клетки снова прикрепятся, а мертвые - нет. Через пару часов, когда здоровые клетки снова прикрепятся к субстрату, Зеоцин можно вернуть в среду.

При необходимости реагент зеоцин можно нанести на YPD-пластины для селекции дрожжей. Есть сообщение, что это хорошо работает, если это делается с использованием 10-15 стеклянных шариков диаметром 3 мм. Однако рекомендуется провести некоторую оптимизацию, поскольку верхнее нанесение может снизить эффективность антибиотиков.

Дата на пробирке – это дата производства, а не срок годности. Об этом свидетельствует изображение здания на этикетке, обозначающее производственное предприятие.

Селективный реагент Zeocin (кат. № R25001) содержит 1 г селективного антибиотика Zeocin, поставляемого в виде раствора 100 мг/мл (кат. № 450430) в 8 флаконах по 1,25 мл. Кат. № 450430 связан с определенным номером партии, который присваивается нашей системой отслеживания производства, и это номер партии указан на упаковке. Сертификат анализа (COA) также создается на основе этого номера детали упаковки и номера партии.

Каждый из 8 флаконов, в свою очередь, имеет кат. № 460509, который связан с другим номером партии, присвоенным нашей системой отслеживания производства. Этот номер партии в основном используется для наших внутренних целей инвентаризации.