SuperScript IV VILO Master Mix с ezDNase, 50 реакций для ПЦР в реальном времени

Да, набор TaqMan Cells-to-CT Express Kit включает Express ezDNase, который можно добавлять в лизирующий раствор Express Lysis Solution для удаления гДНК во время лизиса клеток. Express ezDNase — это двухцепочечная, термолабильная ДНКаза, которая переваривает только гДНК, что делает ее совместимой с последующей реакцией обратной транскрипции. Фермент автоматически инактивируется во время этапа тепловой инактивации, включенного в программу обратной транскрипции. Чтобы избежать обнаружения гДНК, мы рекомендуем использовать TaqMan Gene Expression Assay, специально разработанный для охвата границы интрон-экзон. Такие анализы обозначаются суффиксом '_m1'. Более подробную информацию можно найти здесь.

Find additional tips, troubleshooting help, and resources within our Real-Time PCR and Digital PCR Applications Support Center.

Фермент Invitrogen ezDNase — это новый тип ДНКазы, обладающий высокой специфичностью к двухцепочечной ДНК. Он не проявляет активности в отношении одноцепочечной ДНК в реакциях обратной транскрипции (праймеры или зонды) или РНК. Фермент также термолабилен — он быстро инактивируется при температурах, типичных для реакции SuperScript IV RT (например, 50°C). Поэтому дополнительный этап инактивации не требуется в RT-qPCR.

Для приложений RT-qPCR мы рекомендуем использовать Invitrogen SuperScript IV VILO Master Mix. Настройка реакции синтеза кДНК с этой мастер-смесью требует меньше этапов пипетирования и, следовательно, снижает вариативность данных. SuperScript IV RT, как компонент мастер-смеси, обеспечивает высочайшую эффективность этапа синтеза кДНК по сравнению с продуктами конкурентов.

Единственное изменение заключается в том, что время инкубации для реакции обратной транскрипции было сокращено с 50 минут до 10 минут. Все остальные параметры и этапы остались прежними.

Мы рекомендуем секвенировать до 5 образцов ДНК или РНК (4 образца и не содержащий матрицу контроль (NTC)) на одном чипе Ion 550.

При сравнении с SuperScript III RT (и RT других производителей) в реакции синтеза 9 kb кДНК, SuperScript IV RT успешно выполнил синтез всего за 10 минут и сделал это со сравнимым (или улучшенным) выходом (что показано плотностью полосы на геле).

Oncomine Comprehensive Assay Plus для ручного приготовления библиотек (кат. № A46721) предназначен для подготовки библиотек образцов ДНК и РНК со штрих-кодами. В состав набора входят Oncomine Comprehensive Assay Plus DNA (2-пула) (Part No. A45615), RNA Oncomine Comprehensive Assay v3M (2-пула) (Part No. A33637) и два набора Ion AmpliSeq Library Kit Plus (кат. № 4488990). Предоставляется достаточно реагентов для подготовки библиотек из 24 образцов.

SuperScript IV VILO Master Mix содержит SuperScript IV RT, ингибитор рибонуклеазы и вспомогательный белок. Вспомогательный белок помогает повысить эффективность реакции обратной транскрипции и, следовательно, увеличить выход кДНК. Эта мастер-смесь позволяет упростить настройку реакции, уменьшив количество пипетирований и уменьшив вариативность между образцами.

Для Oncomine Comprehensive Assay Plus с ручной подготовкой библиотеки требуется 10 нг нуклеиновой кислоты на пул (20 нг ДНК и 20 нг РНК), выделенных из образцов FFPE, включая тонкоигольные биопсии.

Фермент ezDNase обладает высокой специфичностью к двухцепочечной ДНК и не повреждает РНК и одноцепочечную ДНК. Высокая специфичность его действия делает этап деактивации в значительной степени неактуальным в последующих реакциях обратной транскрипции. При необходимости фермент ezDNase можно инактивировать инкубацией при 55 градусах C в течение 2 минут.

Анализ оптимизирован для использования с образцами, фиксированными в формалине и заключенными в парафин (FFPE).

Oncomine Comprehensive Assay Plus, ручное приготовление библиотеки (Кат. № A46721) — это целевой анализ секвенирования нового поколения (NGS), который позволяет обнаруживать однонуклеотидные варианты (SNV), вставки и делеции (INDEL), вариации числа копий (CNV), генные слияния, варианты сплайсинга, мутационную нагрузку опухоли (TMB) и микросателлитную нестабильность (MSI) в более чем 500 уникальных генах. Эта версия анализа предназначена для ручного приготовления библиотеки, а не для автоматизированного приготовления библиотеки с использованием системы Ion Chef.

Мы не создали набор для одношаговой ОТ-ПЦР в реальном времени, содержащий SuperScript IV RT для ПЦР в реальном времени. Однако он включен в наборы для одношаговой ОТ-ПЦР с конечной точкой:

Мы также предлагаем двухшаговый набор для ОТ-ПЦР в реальном времени, содержащий SuperScript IV RT:

Для одношаговой ОТ-ПЦР мы предлагаем набор с SuperScript III RT:

Для SKUs на 50 реакций контроль без обратной транскриптазы рассчитан на 50 реакций. Для SKUs на 500 реакций контроль без обратной транскриптазы рассчитан на 250 реакций, что более чем достаточно для контрольной реакции.

Это сделано для того, чтобы исключить возможные систематические ошибки, возникающие при использовании только oligo (dT)18 или только случайных гексамерных праймеров. Хотя данные показывают, что использование одних только случайных гексамеров обеспечивает такое же хорошее количественное определение, как и комбинация двух праймеров. Некоторые ученые предпочитают комбинацию, поскольку считают, что она может улучшить качество данных.

SuperScript IV VILO Master Mix обладает повышенной термостабильностью, что позволяет повысить температуру инкубации обратной транскрипции для работы со структурной сложностью, часто связанной с GC-богатыми матрицами. Наши тесты показывают, что по сравнению с другими наборами или мастер-миксами для синтеза кДНК, повышение температуры реакции приводит к минимальной потере эффективности синтеза кДНК для SuperScript IV VILO Master Mix. Это говорит о том, что он является лучшим выбором, если для синтеза кДНК из GC-богатых матриц требуется высокая температура реакции.

Рекомендуемая температура реакции для SuperScript IV VILO Master Mix составляет 50 градусов C. Отдел исследований и разработок проверил стабильность SSIV VILO при более высоких температурах, и он очень хорошо работает даже при 65 градусах C.

SuperScript IV VILO Master Mix использует обратную транскриптазу SuperScript IV (RT) в оптимизированной формуле мастер-микса, в то время как SuperScript VILO Master Mix и наборы SuperScript VILO используют обратную транскриптазу SuperScript III. SuperScript IV RT имеет значительно улучшенный профиль производительности по сравнению с SuperScript III RT по термостабильности, чувствительности, выходу, процессивности и способности эффективно синтезировать кДНК из широкого спектра образцов РНК, даже тех, которые имеют субоптимальную чистоту и целостность.

SuperScript IV VILO Master Mix является улучшенной версией SuperScript VILO Master Mix и cDNA Synthesis Kit. Он предназначен для использования в синтезе кДНК в двухэтапных RT-qPCR приложениях для анализа экспрессии генов.