SuperScript IV VILO Master Mix, 50 реакций для обратной транскрипции и кПЦР

Мы рекомендуем использовать тотальную РНК из клеток Т-клеточного лейкоза (Jurkat) (Cat. No. AM7858) в качестве контрольного образца. Тотальная РНК из клеток Т-клеточного лейкоза (Jurkat) получена из клеточной линии, состоящей из одного Т-клеточного клонотипа. Запуск анализа Oncomine TCR Beta-LR Assay на тотальной РНК Jurkat позволит обнаружить один клонотип.

Для образцов FFPE мы рекомендуем SSIV VILO Master Mix. Эта смесь лучше работает с деградировавшей РНК.

В отличие от других панелей AmpliSeq, BED-файлов не существует и эталон не требуется. Весь последующий анализ выполняется в Ion Reporter Software.

Фермент Invitrogen ezDNase — это новый тип ДНКазы, обладающий высокой специфичностью к двухцепочечной ДНК. Он не проявляет активности в отношении одноцепочечной ДНК в реакциях обратной транскрипции (праймеры или зонды) или РНК. Фермент также термолабилен — он быстро инактивируется при температурах, типичных для реакции SuperScript IV RT (например, 50°C). Поэтому дополнительный этап инактивации не требуется в RT-qPCR.

Мы протестировали набор Ion Library Equalizer Kit с этим набором для количественного определения библиотеки, и он работает, но ручная балансировка ввода библиотеки в прибор Ion Chef предпочтительнее.

Для приложений RT-qPCR мы рекомендуем использовать Invitrogen SuperScript IV VILO Master Mix. Настройка реакции синтеза кДНК с этой мастер-смесью требует меньше этапов пипетирования и, следовательно, снижает вариативность данных. SuperScript IV RT, как компонент мастер-смеси, обеспечивает высочайшую эффективность этапа синтеза кДНК по сравнению с продуктами конкурентов.

Для создания отчетов требуются Torrent Suite Software 5.6 и Ion Reporter Software 5.6. В Torrent Suite Software 5.6 для использования с Oncomine TCR Beta-LR Assay предусмотрено два шаблона запланированного запуска.

Единственное изменение заключается в том, что время инкубации для реакции обратной транскрипции было сокращено с 50 минут до 10 минут. Все остальные параметры и этапы остались прежними.

Анализ Oncomine TCR Beta-LR был разработан и проверен для использования на системе Ion GeneStudio S5 Series. Анализ можно использовать с системой Ion PGM, однако эта конфигурация прибора не поддерживается.

При сравнении с SuperScript III RT (и RT других производителей) в реакции синтеза 9 kb кДНК, SuperScript IV RT успешно выполнил синтез всего за 10 минут и сделал это со сравнимым (или улучшенным) выходом (что показано плотностью полосы на геле).

Вот компоненты набора Oncomine TCR Beta-LR Assay:

- Oncomine TCR Beta‑LR Panel
- Ion AmpliSeq Library Kit Plus
- Ion Select Barcode Adapters

SuperScript IV VILO Master Mix содержит SuperScript IV RT, ингибитор рибонуклеазы и вспомогательный белок. Вспомогательный белок помогает повысить эффективность реакции обратной транскрипции и, следовательно, увеличить выход кДНК. Эта мастер-смесь позволяет упростить настройку реакции, уменьшив количество пипетирований и уменьшив вариативность между образцами.

Пул праймеров имеет концентрацию 5X.

Анализ Oncomine TCR Beta-LR позволяет проводить РНК-секвенирование длинными прочтениями (длина ампликона до 400 п.н.) для полной характеристики бета-цепи Т-клеточного рецептора (TCR Beta), включая все три комплементарно-определяющие области (CDR1, 2 и 3) вариабельного гена. Это позволяет проводить аллель-специфическое исследование TCR Beta для потенциального прогнозирования лекарственно-опосредованных нежелательных явлений.

Мы не создали набор для одношаговой ОТ-ПЦР в реальном времени, содержащий SuperScript IV RT для ПЦР в реальном времени. Однако он включен в наборы для одношаговой ОТ-ПЦР с конечной точкой:

Мы также предлагаем двухшаговый набор для ОТ-ПЦР в реальном времени, содержащий SuperScript IV RT:

Для одношаговой ОТ-ПЦР мы предлагаем набор с SuperScript III RT:

Праймеры предоставляются в виде одного пула.

Для SKUs на 50 реакций контроль без обратной транскриптазы рассчитан на 50 реакций. Для SKUs на 500 реакций контроль без обратной транскриптазы рассчитан на 250 реакций, что более чем достаточно для контрольной реакции.

На чипе Ion 530 можно мультиплексировать до 16 образцов, на чипе Ion 520 - до 4 образцов и на чипе Ion 318 - до 4 образцов.

Это сделано для того, чтобы исключить возможные систематические ошибки, возникающие при использовании только oligo (dT)18 или только случайных гексамерных праймеров. Хотя данные показывают, что использование одних только случайных гексамеров обеспечивает такое же хорошее количественное определение, как и комбинация двух праймеров. Некоторые ученые предпочитают комбинацию, поскольку считают, что она может улучшить качество данных.

SuperScript IV VILO Master Mix обладает повышенной термостабильностью, что позволяет повысить температуру инкубации обратной транскрипции для работы со структурной сложностью, часто связанной с GC-богатыми матрицами. Наши тесты показывают, что по сравнению с другими наборами или мастер-миксами для синтеза кДНК, повышение температуры реакции приводит к минимальной потере эффективности синтеза кДНК для SuperScript IV VILO Master Mix. Это говорит о том, что он является лучшим выбором, если для синтеза кДНК из GC-богатых матриц требуется высокая температура реакции.

Различные типы исследовательских образцов, включая свежезамороженные ткани, цельную кровь и сортированные T-клетки, совместимы с анализом Oncomine TCR Beta-LR.

Рекомендуемая температура реакции для SuperScript IV VILO Master Mix составляет 50 градусов C. Отдел исследований и разработок проверил стабильность SSIV VILO при более высоких температурах, и он очень хорошо работает даже при 65 градусах C.

Секвенирование репертуара Т-клеток помогает:

- Характеризовать разнообразие и изучать особенности Т-лимфоцитов в крови и инфильтрированных опухолях
- Изучать полиморфизмы генов вариабельности, участвующие в аутоиммунных заболеваниях или иммуноопосредованных нежелательных явлениях
- Изучать производство и функцию терапевтических или инженерных Т-клеток

Этого набора достаточно для 24 образцов.

SuperScript IV VILO Master Mix использует обратную транскриптазу SuperScript IV (RT) в оптимизированной формуле мастер-микса, в то время как SuperScript VILO Master Mix и наборы SuperScript VILO используют обратную транскриптазу SuperScript III. SuperScript IV RT имеет значительно улучшенный профиль производительности по сравнению с SuperScript III RT по термостабильности, чувствительности, выходу, процессивности и способности эффективно синтезировать кДНК из широкого спектра образцов РНК, даже тех, которые имеют субоптимальную чистоту и целостность.

SuperScript IV VILO Master Mix является улучшенной версией SuperScript VILO Master Mix и cDNA Synthesis Kit. Он предназначен для использования в синтезе кДНК в двухэтапных RT-qPCR приложениях для анализа экспрессии генов.

Oncomine TCR Beta-LR Assay — это исследовательский анализ на основе РНК для секвенирования нового поколения (NGS), который позволяет охарактеризовать последовательности бета-рецептора Т-клеток (TCR Beta), включая все три комплементарно-определяющих региона (CDR1, 2 и 3) вариабельного гена. Анализ измеряет разнообразие репертуара Т-клеток, а также клональную экспансию, и позволяет идентифицировать аллель-специфические полиморфизмы.