Набор для преамплификации кДНК из единичных клеток/малого количества материала SuperScript™ IV, 384 реакции

Для всех методов обнаружения на основе TaqMan мы рекомендуем использовать TaqMan Fast Advanced Master Mix.

Для всех методов обнаружения на основе SYBR Green мы рекомендуем использовать PowerTrack SYBR Green Master Mix.

Количество циклов зависит от типа образца и количества исходного материала.
Например:
- 21 цикл для 2 пг общей РНК
- 18 циклов для 10 пг общей РНК или отдельных клеток
- 15 циклов для 100 пг общей РНК или до 10 клеток
- 11 циклов для 1–10 нг общей РНК или 100–1000 клеток
- Количество РНК в клетках может варьироваться в зависимости от типа клетки, клеточного цикла и состояния клеток. Для достижения желаемого выхода может потребоваться оптимизация количества циклов ПЦР. Для более мелких клеток, таких как Jurkat, Daudi или мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), требуется дополнительно 2–3 цикла.

Фермент Invitrogen ezDNase — это новый тип ДНКазы, обладающий высокой специфичностью к двухцепочечной ДНК. Он не проявляет активности в отношении одноцепочечной ДНК в реакциях обратной транскрипции (праймеры или зонды) или РНК. Фермент также термолабилен — он быстро инактивируется при температурах, типичных для реакции SuperScript IV RT (например, 50°C). Поэтому дополнительный этап инактивации не требуется в RT-qPCR.

Мастер-микс содержит Platinum SuperFi U DNA Polymerase. Он обеспечивает те же преимущества, что и Platinum SuperFi II DNA Polymerase, но также совместим с урацилом.

Для приложений RT-qPCR мы рекомендуем использовать Invitrogen SuperScript IV VILO Master Mix. Настройка реакции синтеза кДНК с этой мастер-смесью требует меньше этапов пипетирования и, следовательно, снижает вариативность данных. SuperScript IV RT, как компонент мастер-смеси, обеспечивает высочайшую эффективность этапа синтеза кДНК по сравнению с продуктами конкурентов.

Лизирующий буфер входит в состав набора, поэтому можно использовать интактные клетки млекопитающих. Очистка тотальной РНК требуется для предварительной амплификации кДНК из РНК, выделенной из растений, грибов или других организмов, содержащих клеточную стенку.

TaqMan PreAmp Master Mix предназначен для целевой преамплификации до 100 мишеней из небольшого количества кДНК, в то время как SuperScript IV Single Cell/Low Input cDNA PreAmp Kit позволяет проводить глобальную преамплификацию полноразмерной кДНК из отдельных клеток или малого количества РНК. Он предоставляет реагенты для лизиса клеток, обратной транскрипции и этапов преамплификации.

Единственное изменение заключается в том, что время инкубации для реакции обратной транскрипции было сокращено с 50 минут до 10 минут. Все остальные параметры и этапы остались прежними.

Удаление рРНК или обогащение мРНК не требуется, поскольку амплифицируется только поли(A)-содержащая РНК.

Набор SuperScript IV Single Cell/Low Input cDNA PreAmp Kit был протестирован только с шариками Agencourt AMPure XP. Поэтому мы не можем рекомендовать какие-либо альтернативы.

При сравнении с SuperScript III RT (и RT других производителей) в реакции синтеза 9 kb кДНК, SuperScript IV RT успешно выполнил синтез всего за 10 минут и сделал это со сравнимым (или улучшенным) выходом (что показано плотностью полосы на геле).

Мы рекомендуем использовать Agencourt AMPure XP beads в соответствии с протоколом, представленным в руководстве пользователя SuperScript IV Single Cell/Low Input cDNA PreAmp Kit.

Для последующего анализа методом NGS (секвенирование нового поколения), преамплифицированную кДНК следует очистить, чтобы удалить остаточные праймеры, нуклеотиды и ферменты, которые могут повлиять на подготовку библиотеки. Для анализа продукта с помощью qPCR очистка не требуется, но ее можно использовать для концентрирования образцов для обнаружения целей с низкой экспрессией. Для неочищенных образцов кДНК образцы следует разбавить в 1:10 или 1:100 перед qPCR. Для очищенных образцов кДНК разбавление не требуется. Этап очистки также рекомендуется перед хранением преамплифицированной кДНК при температуре -20 градусов C более 1 недели.

Этот набор разработан для глобального полноразмерного синтеза кДНК и предаплификации. Однако, при последующем анализе можно анализировать либо весь транскриптом, либо конкретные интересующие цели. Он совместим с последующим анализом как с помощью секвенирования нового поколения (NGS), так и с ПЦР в реальном времени.

Этот набор предназначен для глобальной полноразмерной преамплификации кДНК. Он использует технологию SMART с праймированием на основе олиго(dT). Поэтому для получения полноразмерной кДНК мы рекомендуем использовать высококачественную интактную поли(A) РНК.