Набор для синтеза кДНК SuperScript IV CellsDirect™

RT-мастер-микс содержит как случайные праймеры, так и олиго-dT праймеры.

И то, и другое. Мастер-микс для обратной транскрипции содержит как случайные гексамеры, так и олиго(dT) праймеры.

Фермент Invitrogen ezDNase — это новый тип ДНКазы, обладающий высокой специфичностью к двухцепочечной ДНК. Он не проявляет активности в отношении одноцепочечной ДНК в реакциях обратной транскрипции (праймеры или зонды) или РНК. Фермент также термолабилен — он быстро инактивируется при температурах, типичных для реакции SuperScript IV RT (например, 50°C). Поэтому дополнительный этап инактивации не требуется в RT-qPCR.

Для приложений RT-qPCR мы рекомендуем использовать Invitrogen SuperScript IV VILO Master Mix. Настройка реакции синтеза кДНК с этой мастер-смесью требует меньше этапов пипетирования и, следовательно, снижает вариативность данных. SuperScript IV RT, как компонент мастер-смеси, обеспечивает высочайшую эффективность этапа синтеза кДНК по сравнению с продуктами конкурентов.

Единственное изменение заключается в том, что время инкубации для реакции обратной транскрипции было сокращено с 50 минут до 10 минут. Все остальные параметры и этапы остались прежними.

Все реагенты в наборе для синтеза кДНК SuperScript IV CellsDirect были протестированы и оптимизированы для протокола прямой обратной транскрипции. Важно использовать только реагенты, предлагаемые в наборе, и следовать протоколу. Эффективность может быть снижена, если использовать лизирующий раствор из других источников.

При сравнении с SuperScript III RT (и RT других производителей) в реакции синтеза 9 kb кДНК, SuperScript IV RT успешно выполнил синтез всего за 10 минут и сделал это со сравнимым (или улучшенным) выходом (что показано плотностью полосы на геле).

Мастер-микс SuperScript IV в наборе для синтеза кДНК SuperScript IV CellsDirect специально разработан и оптимизирован для протокола прямой обратной транскрипции. Мы не рекомендуем использовать мастер-микс SuperScript IV VILO для замены мастер-микса SuperScript IV, поставляемого в наборе.

Мы рекомендуем следовать всем этапам, рекомендованным в протоколе набора для синтеза кДНК SuperScript IV CellsDirect, чтобы гарантировать оптимальные, воспроизводимые результаты. Этап со Стоп-раствором после лизиса клеток необходим для полного ингибирования ферментов, используемых на этапе лизиса, и, следовательно, для эффективного проведения последующих реакций (ОТ и ПЦР). Этап остановки нельзя пропустить, если используются усилитель лизиса и ДНКаза I. Проще говоря, если усилитель лизиса остается активным, он может гидролизовать SuperScript IV RT и другие белки в ОТ-ПЦР. Если ДНКаза I остается активной, она может гидролизовать продукты ПЦР.

В качестве положительного контроля для реакций лизиса/ОТ мы рекомендуем использовать Xeno RNA Control из набора SYBR Green Cells-to-CT Control Kit (кат. № 4402959), который включает специфические ПЦР-праймеры для анализов SYBR Green, или из набора TaqMan Cells-to-CT Control Kit (кат. № 4386995), который включает ПЦР-праймеры и зонды для анализов TaqMan.

Протокол занимает около 35 минут, включая этапы лизиса и обратной транскрипции (ОТ).

Мы рекомендуем обрабатывать образцы ДНКазой I, если вы используете более 100 клеток на образец. Если вы используете 1-100 клеток на образец, добавление ДНКазы (и усилителя лизиса) в лизирующий раствор является необязательным. В этом случае используйте только рекомендованное количество лизирующего раствора, инкубируйте в течение 7 минут при комнатной температуре и не используйте стоп-раствор. Для реакции обратной транскрипции отрегулируйте объем нуклеазо-свободной водой.

Да, вы можете приобрести ДНКазу I (Кат. № 18047019) отдельно.

Для образцов с количеством клеток более 10 000 мы рекомендуем использовать скорректированные объемы реагентов для реакции лизиса. Мы протестировали различные комбинации реагентов и обнаружили, что для образцов клеток высокой плотности лучше использовать более высокие объемы реакции на этапе лизиса. Для получения более подробной информации обратитесь к руководству пользователя набора для синтеза кДНК SuperScript IV CellsDirect и найдите раздел "Рекомендуемые объемы для образцов клеток высокой плотности" на странице 20.

Для анализа ПЦР с конечной точкой с использованием набора для синтеза кДНК SuperScript IV CellsDirect мы рекомендуем использовать ПЦР-мастер-микс Platinum SuperFi II (2X)/Platinum SuperFi II Green PCR Master Mix (2X) (Cat. No. 12368010, 12369010) или ПЦР-мастер-микс Platinum II Hot-Start (2X)/Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X) (Cat. No. 14000012, 14001012).

Да, однако мы рекомендуем убедиться, что клетки хранятся при -70 градусах C и что все среды удалены до начала этапа лизиса клеток

Вы можете приобрести лизирующие реагенты SuperScript IV CellsDirect (Cat. No. 11750550) отдельно. Этот набор включает в себя лизирующий раствор SuperScript IV CellsDirect, стоп-раствор SuperScript IV CellsDirect и усилитель лизиса.

Мы рекомендуем держать клетки на льду до начала процедуры лизиса клеток. Доставайте клетки со льда только после добавления лизирующего раствора. Для мониторинга деградации РНК мы рекомендуем добавить положительный контроль РНК в реакцию обратной транскрипции.

Для предотвращения заражения нуклеазами мы рекомендуем следующее:
- Носите лабораторные перчатки во время процедур.
- Используйте наконечники для пипеток, не содержащие нуклеиновые кислоты, для работы с реагентами и не помещайте использованные наконечники в контейнеры с реагентами.
- Перед началом работы продезинфицируйте лабораторные столы и пипетки.
- Плотно и медленно закрывайте крышки пробирок и всегда держите их закрытыми после каждого использования.

Мы рекомендуем хранить раствор SuperScript IV CellsDirect Stop Solution, ДНКазу I, усилитель лизиса, SuperScript IV RT Master Mix, SuperScript IV No RT Control при -20 градусах C, в то время как раствор SuperScript IV CellsDirect Lysis Solution следует хранить при 4 градусах C.

При использовании набора для синтеза кДНК SuperScript IV CellsDirect нет необходимости добавлять дополнительные праймеры. Смесь праймеров oligo(dT) и случайных праймеров уже содержится в мастер-миксе SuperScript IV RT.

Да, набор SuperScript IV CellsDirect cDNA Synthesis Kit - хороший выбор для обнаружения генов с низкой экспрессией. Набор содержит SuperScript IV Reverse Transcriptase, которая обладает значительно улучшенной устойчивостью к различным ингибиторам, которые могут мешать синтезу кДНК, и значительно лучшей процессивностью. Эти особенности SuperScript IV Reverse Transcriptase позволяют чувствительно обнаруживать гены с низким уровнем экспрессии.
Для qPCR-анализа с использованием набора SuperScript IV CellsDirect cDNA Synthesis Kit мы рекомендуем использовать PowerTrack SYBR Green Master Mix (кат. № A46012) для анализов SYBR Green и TaqMan Fast Advanced Master Mix (кат. № 4444556) для анализов TaqMan.
Для повышения чувствительности обнаружения в qPCR вы можете попробовать добавить больше кДНК в реакцию qPCR, следуя рекомендациям по внесению кДНК в соответствующем руководстве.

С набором для синтеза кДНК SuperScript IV CellsDirect каждая реакция происходит в одной пробирке. Эта особенность минимизирует потерю реагентов, потерю образца и время обработки. Кроме того, весь объем лизата можно использовать в реакции синтеза первой цепи кДНК, обеспечивая достаточное количество исследуемого материала для приложений с единичными клетками. Для дальнейшего анализа используйте наши рекомендуемые мастер-миксы для qPCR и ПЦР с конечной точкой для высокой чувствительности обнаружения, как показано ниже:

Для qPCR анализа мы рекомендуем использовать PowerTrack SYBR Green Master Mix (Кат. № A46012) для SYBR Green анализов и TaqMan Fast Advanced Master Mix (Кат. № 4444556) для TaqMan анализов.

Для ПЦР анализа с конечной точкой мы рекомендуем использовать Platinum SuperFi II PCR Master Mix (2X)/Platinum SuperFi II Green PCR Master Mix (2X) (Кат. № 12368010, 12369010) или Platinum II Hot-Start PCR Master Mix (2X)/Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X) (Кат. № 14000012, 14001012).

Для удаления геномной ДНК из конечной реакции мы рекомендуем следующее:
- Убедитесь, что ДНКаза I добавлена в лизирующий раствор и инкубация проводится как описано.
- Убедитесь, что лизирующие реагенты хранятся на льду в течение всей процедуры.
- Убедитесь, что лизирующая реакция проводится при комнатной температуре.
- Используйте праймеры для экзон-экзонных соединений, которые специфичны для кДНК и не связываются с геномной ДНК.
- Убедитесь, что вся среда удалена из лунок/пробирок (клеток).

Вот список клеточных линий, которые были протестированы на совместимость с набором SuperScript IV CellsDirect cDNA Synthesis Kit:

Клеточная линия; Свойства культивирования; Организм; Ткань
- HeLa; адгезионная; Homo sapiens; аденокарцинома шейки матки
- HeLa S3; суспензионная; Homo sapiens; аденокарцинома шейки матки
- Raji; суспензионная; Homo sapiens; B лимфоцит
- NIH/3T3; адгезионная; Mus Musculus (мышь); эмбриональный фибробласт
- HEK-293; адгезионная; Homo sapiens; почка
- Jurkat; суспензионная; Homo sapiens; острый Т-клеточный лейкоз
- Daudi; суспензионная; Homo sapiens; лимфома Беркитта
- K562; суспензионная; Homo sapiens; костный мозг
- iPSC; адгезионная; Homo sapiens; стволовые клетки
- Balb/3T3; адгезионная; Mus Musculus (мышь); эмбриональный фибробласт

Да, набор SuperScript IV CellsDirect cDNA Synthesis Kit можно использовать с различными типами культивируемых клеток: адгезивными, суспензионными и клетками, отсортированными методом FACS.

Для анализа ПЦР в реальном времени с набором для синтеза кДНК SuperScript IV CellsDirect мы рекомендуем использовать PowerTrack SYBR Green Master Mix (кат. № A46012) для анализов SYBR Green и TaqMan Fast Advanced Master Mix (кат. № 4444556) для анализов TaqMan.

Нет, вам нужно заказывать реагенты для ПЦР в реальном времени отдельно.

С набором для синтеза кДНК SuperScript IV CellsDirect вы можете обнаружить РНК от единичных клеток до 10 000 клеток на образец с результатами, эквивалентными результатам, полученным из очищенной РНК.