SuperScript III SuperMix для qRT-PCR: высокоточный синтез первой цепи кДНК

Вы можете хранить вашу кДНК при температуре 2-6 градусов Цельсия до 24 часов. Для длительного хранения храните кДНК при температуре от -15 до -25 градусов Цельсия и добавьте ЭДТА до конечной концентрации 1 мМ для предотвращения деградации.

Если продукты амплификации образуются в контрольной пробирке/лунке, не содержащей обратную транскриптазу (т.е. в контроле без ОТ), может потребоваться удалить остаточную геномную ДНК из образца РНК. Используйте следующий протокол для удаления геномной ДНК из препарата тотальной РНК. Случайные праймеры - лучший выбор для деградировавшей РНК, РНК с сильной вторичной структурой, не-полиаденилированной РНК или прокариотической РНК. Рекомендуется только для двухступенчатой ОТ-ПЦР и обычно дает самые высокие выходы, хотя кДНК не обязательно будет полноразмерной. Олиго(dT) праймеры хорошо использовать при попытке получить полноразмерную кДНК из 2-ступенчатой ОТ-ПЦР. На реакцию влияет вторичная структура и качество РНК. Ген-специфические праймеры следует использовать для очень специфических, в основном одноступенчатых реакций ОТ-ПЦР.Случайные праймеры - лучший выбор для деградировавшей РНК, РНК с сильной вторичной структурой, не-полиаденилированной РНК или прокариотической РНК. Рекомендуется только для двухступенчатой ОТ-ПЦР и обычно дает самые высокие выходы, хотя кДНК не обязательно будет полноразмерной. Олиго(dT) праймеры хорошо использовать при попытке получить полноразмерную кДНК из 2-ступенчатой ОТ-ПЦР. На реакцию влияет вторичная структура и качество РНК. Ген-специфические праймеры следует использовать для очень специфических, в основном одноступенчатых реакций ОТ-ПЦР.

Добавьте следующее в автоклавированную 0,5 мл микроцентрифужную пробирку на льду:
1.Тотальная РНК, в идеале, менее или равна 1 µг. (См. Примечание 1 ниже.)
2.1.0 µл 10X ДНКазной буфера (200 мМ Tris, pH 8.3, 500 мМ KCl, 20 мМ MgCl2).
3.0.1 Ед-3.0 Ед ДНКазы I (без РНКазы, кат. № 18047019) или 1.0 Ед ДНКазы I, Amplification Grade (кат. № 18068015. (См. Примечание 2 ниже.)
4.Доведите объем до 10 µл водой, обработанной ДЭПК.
5.Инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 мин. (См. Примечание 3 ниже.)
6.Остановите реакцию, добавив 1 µл 25 мМ ЭДТА и нагрейте в течение 10 мин при 65 градусах C. (См. Примечание 4 ниже.)
7.Поместите на лед на 1 минуту.
8.Соберите кратким центрифугированием. Эту смесь можно использовать непосредственно для обратной транскрипции.

Обратите внимание на следующее:
1.Чтобы работать с более высокими количествами РНК, увеличьте всю реакцию линейно. Не превышайте 2 µг РНК в реакции 10 µл. Большее количество РНК увеличит вязкость раствора и предотвратит диффузию ДНКазы I и нахождение ДНК.
2.ДНКаза I, Amplification Grade, была тщательно очищена для удаления следов рибонуклеазной активности, обычно связанной с другими препаратами ферментов 'без РНКазы', и не требует добавления плацентарного ингибитора РНКазы.
3.Важно не превышать 15-минутное время инкубации или комнатную температуру инкубации. Более высокие температуры и более длительное время могут привести к Mg2+-зависимому гидролизу РНК.
4.Эта процедура требует тщательного пипетирования всех растворов, чтобы контролировать концентрацию двухвалентного катиона металла (Mg2+).
5.Поскольку ДНКазу I необходимо нагреть до 65 градусов C, чтобы инактивировать фермент, концентрация свободных двухвалентных ионов металла должна быть достаточно низкой (менее 1 мМ) после добавления ЭДТА, чтобы предотвратить химический гидролиз РНК. См. ссылки ниже.
После добавления ЭДТА существует приблизительно молярное соотношение Mg2+ :ЭДТА 1:1. ЭДТА хелатирует молекулы Mg2+ в молярном соотношении 1:1. Следовательно, эту РНК можно непосредственно использовать в реакции обратной транскрипции. Буферы обратной транскрипции первой цепи обычно приводят к конечной концентрации 2,5 мМ Mg2+. Если буфер обратной транскрипции не содержит MgCl2, добавьте его в реакцию до конечной концентрации 2,5 мМ. Это приводит к чистой конечной концентрации приблизительно от 2,25 до 2,5 мМ MgCl2.

Ссылки на гидролиз РНК:
Molekulyarnaya Biologiya (1987) 21:1235-1241.
Ссылки на механизм гидролиза другими катионами:
Eichorn GL and Butzov JY (1965) Biopolymers 3:79.
Butzov JY and Eichorn GL (1965) Biopolymers 3:95.
Farkas WR (1968) Biochim Biophys Acta 155:401.
Авторы первой статьи выражают мнение, что механизм неспецифического гидролиза катионами, который протекает через образование 2',3' циклического фосфата, аналогичен механизму специфического гидролиза, такого как сплайсинг РНК.

Количество матрицы РНК для синтеза кДНК является очень гибким и зависит от количества доступного образца и индивидуальных потребностей. Как правило, 1 мкг тотальной РНК используется в типичной реакции обратной транскрипции объемом 20 мкл.

Некоторые считают, что РНК в дуплексе РНК:ДНК после обратной транскрипции будет препятствовать отжигу ПЦР-праймеров и амплификации кДНК. РНК все еще присутствует при использовании RT с мутацией по РНКазе H. РНКаза H освобождает кДНК от РНК. С другой стороны, некоторые считают, что стадия денатурации при 95 градусах Цельсия приведет к отсоединению РНК-праймеров от ДНК, и поэтому обработка РНКазой H не является необходимой. Таким образом, этот шаг является необязательным. Для клонирования более крупных фрагментов обработка РНКазой H может быть полезна.

Это сильно зависит от качества образца. мРНК сама по себе составляет 1-5% от общего количества РНК. В зависимости от используемого праймера и фермента, обратная транскрипция может конвертировать >70% из этого в кДНК.

Случайные праймеры — лучший выбор для деградировавшей РНК, РНК с выраженной вторичной структурой, не-полиаденилированной РНК или прокариотической РНК. Рекомендуется только для двухэтапной ОТ-ПЦР и обычно дает самые высокие выходы, хотя кДНК может быть не обязательно полноразмерной. Праймеры Oligo(dT) хорошо использовать, когда вы пытаетесь получить полноразмерную кДНК из двухэтапной ОТ-ПЦР. На реакцию влияет вторичная структура и качество РНК. Ген-специфические праймеры следует использовать для очень специфичных, в основном одноэтапных реакций ОТ-ПЦР.

Нет, ДТТ необходимо заменить.

Эти ферменты содержат домены RNase H, но они были мутированы. В анализах на обнаружение активности RNase H мы не можем обнаружить какую-либо активность RNase H.

Да, мы продаем буфер M-MLV RT (Cat. No. 18057018), который работает с M-MLV RT, SuperScript II RT и SuperScript III RT.

Нет. После добавления ЭДТА наблюдается приблизительно 1:1 молярное соотношение Mg2+:ЭДТА. ЭДТА хелатирует молекулы Mg2+ в молярном соотношении 1:1. Следовательно, эту РНК можно напрямую использовать в реакции обратной транскрипции. Буферы для обратной транскрипции первой цепи обычно обеспечивают конечную концентрацию 2,5 мМ Mg2+. Если буфер для обратной транскрипции не содержит MgCl2, добавьте его в реакцию до конечной концентрации 2,5 мМ. Это приводит к чистой конечной концентрации примерно от 2,25 до 2,5 мМ MgCl2.

Рекомендуется использовать буфер, поставляемый с ферментом. Небольшие различия объясняются тем, что наборы были разработаны в разное время, возможно, разными группами исследований и разработок.

Нет, если требуется TdT-активность, пожалуйста, используйте нашу SuperScript II RT.

Набор SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit содержит смесь SuperScript III RT и вспомогательных белков, которые помогают повысить эффективность реакции обратной транскрипции и, следовательно, увеличить выход продукта. RT в наборе SuperScript VILO активна при 42 градусах C благодаря вспомогательным белкам.