Набор SMART Digest™ Trypsin, растворимый трипсин, буфер, планшет для сбора

Да, мы рекомендуем следующий протокол, который можно оптимизировать при необходимости:
1. Промойте фильтр Fisher Scientific Vivacon 500 с отсечкой по молекулярной массе 30 кДа (кат. № 14558347) для удаления следовых количеств глицерина, используя полный объем воды. Слейте фильтрат и соберите жидкость. Фильтр готов к использованию. Если вы не хотите использовать фильтр Vivacon немедленно, храните предварительно промытое устройство в холодильнике с водой или буфером, покрывающим поверхность мембраны. Не допускайте высыхания мембраны.
2. Разбавьте образец водой до общего объема 150 мкл на фильтре.
3. Центрифугируйте при 14 000 об/мин в течение 15 минут и выбросьте прошедшую жидкость.
4. Добавьте 150 мкл воды.
5. Центрифугируйте при 14 000 об/мин в течение 15 минут и выбросьте прошедшую жидкость.
6. Добавьте 200 мкл буфера SMART Digest.
7. Замените пробирку для сбора и добавьте 5 мкл растворимого фермента SMART Digest в фильтр.
8. Закройте фильтры парафиновой пленкой, чтобы предотвратить испарение образца во время переваривания. Инкубируйте устройства в нагревательной бане при 70°C в течение 60-90 минут.
9. Дополнительно: при необходимости добавьте ДТТ (3 мкл 50 мМ ДТТ), нагрейте при 37°C и инкубируйте в течение 30 минут. Алкилируйте по мере необходимости (используя 3 мкл 150 мМ алкилирующего реагента).
10. После инкубации добавьте 2 мкл 1% трифторуксусной кислоты в фильтр. Перемешайте в течение 1 минуты.
11. Центрифугируйте фильтрующие устройства при 14 000 об/мин в течение 10 минут.
12. При необходимости измерьте концентрацию белка с помощью спектрофотометра Thermo Scientific NanoDrop или аналогичной процедуры.

Для автоматизации рабочего процесса с использованием набора SMART Digest Soluble Trypsin мы рекомендуем использовать планшеты для глубоких лунок с Sepra Seals или ПЦР-планшеты с привариваемыми пленками в сочетании с автоматизированной платформой для работы с жидкостями. Можно использовать любой нагревательный блок с подогреваемой крышкой, способный обеспечивать равномерный нагрев при 70°C.

Набор совместим с мочевиной до 1M, но не совместим с большинством концентраций гуанидина.

Этот набор совместим со многими поверхностно-активными веществами, включая OGS, CHAPS, Nonidet и NP-40.

На данный момент исследования показали, что, ускоряя реакцию и минимизируя время реакции, наблюдается меньше химических модификаций по сравнению с протоколами, использующими увеличенное время переваривания при более низких температурах. Для получения более подробной информации обратитесь к примечанию по применению под названием 'SMART Digest по сравнению с классическим перевариванием ритуксимаба в растворе для углубленной характеристики пептидного картирования'.

Подробности смотрите в публикации 'Тиол-дисульфидный обмен в гормоне роста человека' (Pharm Res (2016) 33:1370–1382 DOI 10.1007/s11095-016-1879-3). Перегруппировки дисульфидных связей не наблюдалось. Однако свободные цистеины потенциально могут привести к перемешиванию. При необходимости алкилируйте свободные цистеины, чтобы предотвратить перемешивание дисульфидных связей.

Набор SMART Digest Soluble Trypsin был разработан для обеспечения термической стабильности. При работе с ним при высоких температурах (например, 70°C) денатурация и расщепление происходят одновременно. Поэтому для многих количественных рабочих процессов нет необходимости выполнять дополнительные этапы денатурации, восстановления и алкилирования. Однако в ходе этого процесса многие дисульфидные связи останутся неповрежденными. Таким образом, для многих рабочих процессов идентификации рекомендуется проводить восстановление и алкилирование после переваривания. По нашему опыту, денатурирующие и восстанавливающие реагенты негативно влияют на расщепление при использовании наборов SMART Digest Soluble Trypsin.

pH буфера для переваривания, поставляемого в наборе SMART Digest Soluble Trypsin Kit, составляет примерно 8. При использовании при температуре 70°C pH буфера составляет примерно 7. Работа при этом более низком pH помогает предотвратить образование искусственных модификаций.

Буфер SMART Digest в наборе SMART Digest Soluble Trypsin Kit содержит ~ 0.5 M солей. Соли значительно помогают в достижении быстрого переваривания при высоких температурах. Настоятельно рекомендуется обессоливание с использованием переключения клапанов, хотя использование SPE очистки также было успешным.

Буфер SMART Digest был оптимизирован для максимальной активности трипсина при повышенных температурах. Можно использовать и другие буферы, но их применение может негативно повлиять на активность трипсина. Если для вашего приложения требуется использование альтернативного буфера, время и температуру переваривания следует оптимизировать соответствующим образом.

Все белки перевариваются по-разному, поэтому вам потребуется соответствующим образом скорректировать температуру и время инкубации. Мы рекомендуем следующую стратегию для скрининга времени переваривания:
1. Создайте метод в вашем нагревательном блоке, установив желаемую рабочую температуру (мы рекомендуем 70°C). Запустите этот метод и дайте температуре стабилизироваться в течение как минимум 5 минут перед добавлением образцов.
2. Подготовьте восемь идентичных образцов, используя относительно высокую известную концентрацию нативного аналита в рабочей матрице, при необходимости разбавив их до 50 мкл каждый сверхчистой водой.
3. Добавьте к каждому образцу 150 мкл буфера SMART Digest и 5 мкл растворимого фермента SMART Digest в каждую из восьми лунок.
4. Плотно поместите все образцы в предварительно нагретый блок.
5. Периодически (например, каждые 15 минут) извлекайте образец и останавливайте реакцию, используя эквивалентный объем 1% трифторуксусной кислоты или 1% муравьиной кислоты.
6. После инкубации проанализируйте образцы, чтобы определить степень переваривания.
7. Как только пик интактного белка исчезнет, переваривание завершено, и соответствующее время переваривания можно использовать для последующих анализов.

Не восстанавливайте и не алкилируйте образец перед перевариванием. Наши исследования показывают, что химические вещества, используемые для денатурации, восстановления и алкилирования, могут негативно влиять на активность фермента и растворимость белкового образца. Если пептиды, представляющие интерес, требуют восстановления перед анализом, рекомендуется выполнять эти этапы после переваривания.

Как правило, нет необходимости изменять количество используемого трипсина для любого конкретного образца. Исследования показали, что при работе с повышенными температурами и стабильным ферментом реакции значительно менее зависимы от концентрации, чем традиционные протоколы. Для образцов, содержащих менее 5 мкг общего белка, титрование количества фермента может предотвратить помехи в анализе из-за избытка фермента.

Для каждой порции в 5 мкл набора SMART Digest Soluble Trypsin Kit можно легко переварить до 50 мкл плазмы (примерно 3,5 мг белка).

Концентрация фермента трипсина составляет 1 µг/µл, следовательно, в 5 µл будет 5 µг трипсина.

Если субстрат растворим, встряхивание не требуется.

Мы рекомендуем использовать любой нагревательный блок с подогреваемой крышкой, способный обеспечивать равномерный нагрев при 70°C.