Набор для анализа активности ренила-люциферазы (Flash Assay), 1000 реакций

Gaussia, Gaussia-Dura, и Cypridina Люцифераза стабильны в культуральной среде более 24 часов. Как правило, после трансфекции конструкциями, управляемыми CMV, мы наблюдаем постоянно увеличивающийся секретируемый сигнал между 24 и 72 часами.

Самый ранний обнаруживаемый сигнал будет зависеть от силы промотора. Как правило, при сильном промоторе (например, CMV) значительный сигнал, превышающий фоновый, можно увидеть уже через 20 минут. Однако при более слабом индуцируемом промоторе для достижения значительного сигнала, превышающего фоновый, может потребоваться 1-2 часа после индукции.

Наши наборы для анализа qIP люциферазы были сняты с производства, но у нас есть экспрессионные векторы млекопитающих с эпитопными метками (HA или c-Myc) и метками Tluc (TurboLuc люцифераза), а также реагенты для анализа взаимодействия белков qIP для этих наборов.

Вот возможные причины и решения:

- Неспецифическое окисление субстрата: Используйте меньше сыворотки в среде для культивирования клеток; Примечание: Альбумин может увеличить ауто-окисление Варгулина; Избегайте повторного замораживания и оттаивания образца.
- Контрольный образец загрязнен: Используйте новый образец; Меняйте наконечники пипеток после каждой лунки.

Найдите дополнительные советы по устранению неполадок и ресурсы.

Это может быть связано с высокой экспрессией люциферазы. Вот несколько предложений:

Вот возможные причины и решения:

- Использован неоптимизированный лизирующий буфер: Проверьте активность люциферазы в среде, чтобы подтвердить хорошую экспрессию люциферазы; Используйте только предоставленный лизирующий буфер.
- Низкая экспрессия люциферазы: Лизируйте клетки в меньшем объеме 1X Cell Lysis Buffer; Используйте другой промотор или условия роста, чтобы улучшить экспрессию; Увеличьте время интегрирования на приборе; Увеличьте объем образца и реагента на лунку.

Вот возможные причины и решения:

- Недостаточное накопление люциферазы в среде: Инкубируйте клетки дольше.
- Низкая экспрессия люциферазы: Используйте меньше среды на лунку во время эксперимента; Используйте другой промотор или условия роста для улучшения экспрессии; Увеличьте время интегрирования на приборе; Увеличьте объем образца и реагента на лунку.
- Обработка нарушила клеточный секреторный путь: Трансфицируйте клетки плазмидой для конститутивной экспрессии люциферазы (например, с промотором pTK или pCMV); Определите, активно ли люцифераза экспрессируется в среде без обработки. Добавьте обработку; Определите, наблюдается ли соответствующее падение активности люциферазы от конститутивно экспрессируемой плазмиды.

Вот возможные причины и решения:

- Низкая эффективность трансфекции: Оптимизируйте условия трансфекции, используя визуальный контроль трансфекции (например, плазмиду, сверхэкспрессирующую флуоресцентный белок); Проверьте качество плазмидной ДНК - используйте только ДНК для трансфекции; Используйте активно делящиеся клетки с низким пассажем; Используйте другой тип клеток.
- Отсутствие или низкая активность промотора: Используйте условия, известные для активации промотора; Инкубируйте клетки в течение более длительного времени; Измените условия роста для улучшения экспрессии; Используйте другой промотор.
- Субстрат самоокислился: Защищайте субстрат от света и воздуха; Поддерживайте 100X Coelenterazine при -80 градусах C; Поддерживайте 100X Vargulin при -80 градусах C; Приготовьте новый рабочий раствор Coelenterazine, если он используется дольше 8 часов; Приготовьте новый рабочий раствор Vargulin, если он используется дольше 2 часов

Для фетальной бычьей сыворотки (FBS) нет разницы между 10% и 5% FBS. Стоит отметить, что тип сыворотки влияет на анализ люциферазы. Мы протестировали влияние 6 различных типов сывороток (FBS, инактивированная нагреванием FBS, диализированная FBS, обработанная активированным углем FBS, донорская сыворотка взрослой бычьей особи и донорская сыворотка лошади) на секретируемые люциферазы, например, Gaussia, Gaussia-Dura, и Cypridina Luciferases. Заметной разницы между различными типами сывороток не наблюдалось, за исключением донорской сыворотки взрослой бычьей особи. Неизвестные факторы в донорской сыворотке взрослой бычьей особи вызвали до 35% ингибирования активности секретируемой люциферазы. Поэтому мы не рекомендуем использовать донорскую сыворотку взрослой бычьей особи для Gaussia, Gaussia-Dura и Cypridina Luciferases.

Проблемы с белыми планшетами связаны с блокировкой перекрестных помех, отражательной способностью поверхности и склонностью к фосфоресценции. Мы не рекомендуем использовать белые планшеты, потому что они дают гораздо более высокий фон, даже если их адаптировать к темноте в течение 10 минут. Белый пластик не блокирует свет полностью, и часть сигнала пройдет через пластик и будет видна при измерении соседних лунок. Типичная ситуация - при переходе с черных на белые планшеты фон увеличивается примерно вдвое, а сигнал увеличивается примерно в 10 раз. Черные планшеты рекомендуются для наилучшего соотношения сигнал/шум, даже если значения RLU будут ниже. 

Найдите дополнительные советы, помощь в устранении неполадок и ресурсы.

Мы всегда рекомендуем считывать результаты анализа люциферазы без светофильтров для одинарных анализов люциферазы. Использование светофильтров уменьшает количество захватываемого сигнала, что может привести к снижению чувствительности. Светофильтры требуются только для двухспектральных анализов.

Анализы на люциферазу Gaussia и Cypridina можно проводить как на среде, так и на лизате клеток. Анализы на люциферазу Renilla и Firefly можно проводить только на лизате клеток в качестве типа образца. 

Мы предлагаем следующие люциферазные анализы (каждый доступен в форматах Glow и Flash), которые обеспечивают высокочувствительный анализ транскрипционной активности регуляторных элементов в среде культивирования клеток млекопитающих и лизате целых клеток:

- Thermo Scientific Pierce Gaussia Luciferase assays обеспечивают высокочувствительную систему для обнаружения внутриклеточной и секретируемой люциферазной активности при активации промотора или пути в экспериментах с культурой клеток млекопитающих. Люцифераза Gaussia обладает большей стабильностью белка и яркостью сигнала, чем нативная люцифераза Firefly или Renilla. Биолюминесцентный сигнал, производимый люциферазой Gaussia, является результатом окисления целентеразина. Эта реакция не требует аденозинтрифосфата (АТФ) или других кофакторов. Выход света коррелирует с количеством экспрессируемого белка Gaussia, которое пропорционально активности промотора для экспрессии Gaussia.
Примечание: Люцифераза Gaussia представляет собой белок с молекулярной массой ~22 кДа.

- Thermo Scientific Pierce Renilla Luciferase assays обеспечивают высокочувствительную систему для обнаружения внутриклеточной люциферазной активности при активации промотора или пути в экспериментах с культурой клеток млекопитающих. Биолюминесцентный сигнал, производимый зеленой люциферазой Renilla, является результатом окисления целентеразина. Эта реакция не требует аденозинтрифосфата (АТФ) или других кофакторов. Выход света коррелирует с количеством экспрессируемого зеленого белка Renilla, которое пропорционально активности промотора для экспрессии зеленой Renilla.
Примечание: В отличие от Gaussia и Cypridina, зеленая люцифераза Renilla может быть проанализирована только в клеточных лизатах, поскольку она не секретируется в среду культивирования клеток. Зеленая люцифераза Renilla представляет собой белок с молекулярной массой ~36 кДа.

- Thermo Scientific Pierce Cypridina Luciferase assays обеспечивают высокочувствительную систему для обнаружения внутриклеточной и секретируемой люциферазной активности при активации промотора или пути в экспериментах с культурой клеток млекопитающих. Белок люциферазы Cypridina активно секретируется в среду культивирования клеток, что позволяет осуществлять мониторинг активности репортера в живых клетках. Люцифераза Cypridina обладает большей стабильностью белка и яркостью сигнала, чем нативная люцифераза firefly или Renilla. Биолюминесцентный сигнал, производимый люциферазой Cypridina, является результатом окисления варгулина. Эта реакция не требует аденозинтрифосфата (АТФ) или других кофакторов. Выход света коррелирует с количеством экспрессируемого белка Cypridina, которое пропорционально активности промотора для экспрессии Cypridina.
Примечание: Люцифераза Cypridina представляет собой белок с молекулярной массой 61 кДа.

- Thermo Scientific Pierce Firefly Luciferase Assays обеспечивают высокочувствительную систему для обнаружения внутриклеточной люциферазной активности при активации промотора или пути в экспериментах с культурой клеток млекопитающих. Биолюминесцентный сигнал, производимый люциферазой светлячка, является результатом окисления D-Люциферина. Выход света коррелирует с количеством белка светлячка, которое пропорционально активности промотора для экспрессии светлячка.
Примечание: В отличие от Gaussia и Cypridina, люцифераза светлячка может быть проанализирована только в клеточных лизатах, поскольку она не секретируется в среду культивирования клеток.
Примечание: Люцифераза светлячка представляет собой белок с молекулярной массой ~60 кДа, вырабатываемый в природе несколькими видами жуков семейства Lampyridae, который включает роды Photinus и Luciola.