Планшеты с никелевым покрытием, прозрачные, стандартный формат, для колориметрического анализа

Вода, используемая для промывки микропланшетов, а также все реагенты для анализа, должны быть абсолютно сверхчистыми. Это означает, что в воде не должно быть ионов металлов, поскольку они будут связываться с His-меткой и тем самым снижать связывание белка с никель-хелатным комплексом.

Да. Например, используйте имидазол в концентрациях >500 мМ в Tris при pH 7.5 или высокую концентрацию EDTA.

Ионные детергенты (например, SDS) будут мешать связыванию, как и высокие концентрации хелатирующих реагентов, таких как ЭДТА, ЭГТА и очень сильные доноры электронов, такие как ионы металлов.

Чтобы определить приблизительное количество связанного His-меченого белка/пептида, можно использовать стандартную кривую предварительно очищенного препарата.

Предел обнаружения для каждого белка зависит от используемой системы анализа (например, первичного и вторичного антитела, времени инкубации, реагента для обнаружения), доступности His-меченой слитой биомолекулы и размера белка (крупные белки связываются с низкой плотностью). Используя белок 25 кДа с 6xHis-меткой, мы наблюдали предел обнаружения 1,0 нг на лунку (100 мкл).

Никелированные планшеты Pierce чрезвычайно стабильны в течение длительного периода времени, если хранятся при комнатной температуре (20-25 градусов C). Мы гарантируем 12 месяцев срока годности в невскрытой фольгированной упаковке после даты отгрузки.

Да. При настройке анализа следует определить концентрацию His-меченого белка/пептида путем титрования. Мы рекомендуем использовать раствор His-меченого белка/пептида, разбавленный в KCl, в концентрации от 0,01 до 10 мкг/мл. После этого первичные и вторичные антитела следует оптимизировать в соответствии с рекомендациями производителя.

Мы рекомендуем предварительно промывать никелированные планшеты Pierce PBS, содержащим 0,05 % (об./об.) поверхностно-активного вещества Твин-20, чтобы насытить поверхность планшета. Это минимизирует неспецифическое связывание во время анализа и обеспечивает низкий фон.

Да. Взаимодействие зависит от pH, и связывание лучше всего происходит при нейтральном pH или немного выше нейтрального pH. Мы рекомендуем использовать 10 мМ KCl, который имеет нейтральный pH, в качестве буфера для связывания.

Из-за стерических затруднений оптимальная производительность обычно наблюдается, если слитый белок содержит более четырех соседних аминокислотных остатков гистидина, расположенных на терминальном конце. В некоторых случаях аминокислотные остатки гистидина не обязательно должны быть расположены рядом друг с другом - просто убедитесь, что трехмерная структура складывает их рядом друг с другом (например, слитый белок HAT).

Никелевые планшеты Pierce могут посредством простого одношагового протокола связывать все типы His-меченых слитых белков/пептидов. Это включает в себя как очищенные, так и неочищенные клеточные лизаты, содержащие His-меченые слитые белки/пептиды.