Geneticin™ Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL), 20 мл

Все наши антибиотики (Генетицин, Zeocin, Гигромицин B, Бластицидин и Пуромицин) можно использовать вместе для создания множественных стабильных клеточных линий. Однако, для каждой комбинации антибиотиков необходимо построить кривые гибели клеток, поскольку чувствительность к определенному антибиотику, как правило, возрастает при его сочетании с другими антибиотиками.

Нет, неомицин токсичен для клеток млекопитающих. Он также вызывает необратимые повреждения почек и других органов. Генетицин (он же сульфат G418) является менее токсичной и очень эффективной альтернативой для селекции клеток млекопитающих. Неомицин можно использовать для селекции бактерий, но канамицин является предпочтительным препаратом из-за токсичности неомицина.

Если незаменимая культура заражена, исследователи могут попытаться устранить или контролировать загрязнение.

1. Определите, является ли загрязнение бактериями, грибками, микоплазмой или дрожжами. Подробнее о характеристиках каждого загрязнителя можно прочитать здесь.
2. Изолируйте зараженную культуру от других клеточных линий.
3. Очистите инкубаторы и ламинарные боксы с помощью лабораторного дезинфицирующего средства и проверьте HEPA-фильтры.
4. Антибиотики и антимикотики в высоких концентрациях могут быть токсичными для некоторых клеточных линий. Поэтому выполните тест доза-ответ, чтобы определить уровень, при котором антибиотик или антимикотик становится токсичным. Это особенно важно при использовании антимикотика, такого как реагент Gibco Fungizone, или антибиотика, такого как тилозин.

Ниже приведена предлагаемая процедура определения уровней токсичности и деконтаминации культур:

1. Диссоциируйте, посчитайте и разбавьте клетки в среде, не содержащей антибиотиков. Разбавьте клетки до концентрации, используемой для регулярного пассажа клеток.
2. Разлейте клеточную суспензию в многолуночный планшет для культивирования или несколько небольших колб. Добавьте выбранный антибиотик в каждую лунку в диапазоне концентраций. Например, мы предлагаем следующие концентрации для реагента Gibco Fungizone: 0,25, 0,50, 1,0, 2,0, 4,0 и 8,0 мкг/мл.
3. Ежедневно наблюдайте за клетками на предмет признаков токсичности, таких как отслоение, появление вакуолей, уменьшение конфлюентности и округление.
4. Когда токсичный уровень антибиотика определен, культивируйте клетки в течение двух-трех пассажей, используя антибиотик в концентрации, в один-два раза меньшей, чем токсичная концентрация.
5. Культивируйте клетки в течение одного пассажа в среде, не содержащей антибиотиков.
6. Повторите шаг 4.
7. Культивируйте клетки в среде, не содержащей антибиотиков, в течение четырех-шести пассажей, чтобы определить, было ли устранено загрязнение.

Для достижения наилучших результатов оптимальные концентрации для селекции следует определять эмпирически в каждом уникальном эксперименте с помощью кривых доза-ответ. Однако, чтобы получить общее представление о концентрациях, которые работали для отдельных типов клеток, введите “Селекционные антибиотики” в наш основной поиск на www.thermofisher.com.

Пожалуйста, просмотрите следующую страницу, чтобы ознакомиться с предлагаемыми нами антибиотиками для клеточных культур.

Бластицидин: Нуклеозид. Ингибирует синтез белка в прокариотических и эукариотических клетках, вмешиваясь в пептидилтрансферазную реакцию синтеза белка, вызывая преждевременное завершение трансляции.

Генетицин (G418): Аминогликозид. Блокирует синтез белка в клетках млекопитающих, вмешиваясь в рибосомальную функцию.

Гигромицин: Аминоциклитол. Ингибирует синтез белка, нарушая транслокацию и способствуя ошибочной трансляции.

Зеоцин: Интеркалирует с ДНК и расщепляет ее.

Это правда, что процент нерезистентных клеток млекопитающих не округляется и не открепляется от планшета при селекции Зеоцином, как это можно было бы наблюдать при селекции G418 или Гигромицином. Однако, следует наблюдать очень характерные морфологические изменения, происходящие в тех клетках, которые не являются резистентными. Эти клетки, которые прилипают к культуральному планшету, обычно демонстрируют огромное увеличение размера. Это можно лучше всего описать как похожее на воздействие цитомегаловируса, инфицирующего пермиссивные клетки. Форма этих клеток также может измениться, приобретая «инопланетную» форму. При внимательном изучении нерезистентных клеток исследователь должен наблюдать отчетливое разрушение как ядерной, так и плазматической мембран. Даже если «клетки» все еще прикреплены к планшету, у них должен быть вид множества отверстий в этих мембранах. Кроме того, до разрушения мембран можно наблюдать открытые участки в цитоплазме клеток, которые выглядят как большие пустые везикулы. Хотя это и не подтверждено, это можно объяснить разрушением эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи или других каркасных белков. В конце концов, эти «клетки» полностью разрушатся, так что останутся только «нити» белка.

В отличие от этого, клетки, резистентные к Зеоцину, должны продолжать делиться через регулярные промежутки времени, образуя отчетливые скопления клеток или колонии. Не должно быть явных изменений в морфологии, которые можно сравнить с клетками, не находящимися под селекцией с Зеоцином. Именно эти колонии активно делящихся клеток содержат ген резистентности и активно его экспрессируют.

Если есть опасения по поводу прилипания мертвых клеток к планшету, можно сделать следующее, чтобы удалить их: Обработайте планшет в течение пары минут трипсином/версеном. И здоровые резистентные клетки, и мертвые клетки оторвутся от планшета. Затем клетки можно повторно высеять (без селекции Зеоцином), и здоровые клетки снова прикрепятся, а мертвые - нет. Через пару часов, когда здоровые клетки снова прикрепятся к субстрату, Зеоцин можно вернуть в среду.

Специфическая активность Генетицина варьируется от партии к партии. Чтобы создать исходный раствор Генетицина, получите информацию о его активности из этикетки или сертификата анализа. Приготовьте концентрированный исходный раствор с активным весом 50 мг/мл в стерильной дистиллированной воде, забуференном солевом растворе, культуральной среде или буфере HEPES 100 мМ. Примечание: Генетицин в воде имеет кислую реакцию, и добавление его непосредственно в среду часто вызывает немедленное изменение pH, которое будет отчетливо видно как изменение цвета в среде, содержащей феноловый красный. Если среда хорошо забуферена, pH вернется к нормальному в течение нескольких минут или нескольких часов. Если изменение pH вызывает беспокойство, можно приготовить исходный раствор в забуференном растворе, таком как HEPES 100 мМ.

Чувствительность к G418 заметно различается в зависимости от типа клеток, среды для роста клеток и используемой сывороточной добавки. Экспериментально определите подходящую концентрацию для селекции, построив кривую дозовой зависимости. Используйте концентрации от 100 мкг/мл до 2 мг/мл G418 в среде с шагом 200 мкг/мл. Для получения дополнительной информации см. вкладыш к продукту.

Мы рекомендуем Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) (Cat. Nos. 10131035, 10131027), который поставляется в жидкой форме.

Нет. Селективный антибиотик Генетицин (G418 Sulfate) (50 мг/мл) (кат. № 10131027, 10131035) и Гентамицин не являются взаимозаменяемыми. Генетицин убьет агробактерии, если они не трансформированы плазмидой, кодирующей ген устойчивости к неомицину (neo).