Gateway BP Clonase II Enzyme mix: эффективная рекомбинация ДНК

– Проверьте, не была ли реакция трансформирована в штамм E.coli, содержащий эписому F' и ген ccdA – используйте штамм E.coli, не содержащий эписому F', например, DH10B, TOP10.
– Делеция (полная или частичная) гена ccdB – культивируйте в среде с 50-100 мг/мл ампициллина и 15-30 мкг/мл хлорамфеникола.
– Загрязнение от другого устойчивого штамма.
– Проверьте, было ли использовано правильное количество ДНК в реакции.

BP Clonase и LR Clonase поставляются с 5X BP реакционным буфером или 5X LR реакционным буфером, соответственно, в отдельных флаконах и требуют хранения при -80 градусах C. С другой стороны, BP Clonase II и LR Clonase II предлагают удобство предварительно смешанных BP Clonase /LR Clonase и 5X BP/LR реакционного буфера, соответственно. Эти предварительно смешанные составы более стабильны при -20 градусах C.

Обычно, когда после BP-рекомбинации образуются колонии как больших, так и маленьких размеров, мы рекомендуем проанализировать несколько колоний обоих типов с помощью аналитического рестрикционного переваривания, ПЦР с праймерами, специфичными для гена, или секвенирования, чтобы определить, что вы получили, и выбрать оптимальный дальнейший курс действий. Если одна из проанализированных вами колоний содержит желаемый входной клон, вы можете использовать этот входной клон для LR-реакции, чтобы получить желаемый экспрессионный клон.

Существует несколько возможных причин этой проблемы:

– Плазмида была потеряна во время культивирования из-за большого размера или токсичности – Чтобы улучшить результаты в следующий раз, когда вы будете проводить BP-реакцию со сложной вставкой, вы можете попробовать инкубировать чашку для трансформации при 30 градусах C и/или использовать Stbl2 E.coli для стабилизации плазмиды. Мы также рекомендуем провести положительный контроль BP-реакции pEXP7-Tet параллельно с вашей BP-реакцией клонирования интересующего вас гена; результаты этой контрольной реакции дадут вам понять, является ли фенотип больших и маленьких колоний специфичным для вашей интересующей вставки.

– Делеции (полные или частичные) или точечные мутации в гене ccdB – Отрицательный контроль BP-реакции (без добавления BP-клоназы) не должен давать никаких колоний – Если отрицательный контроль без BP-клоназы дает колонии, то кассета ccdB/хлорамфеникола скомпрометирована, и мы рекомендуем получить новый вектор pDONR.

– Фон на чашке для селекции антибиотиком из-за контаминации или просроченного антибиотика – Если вы запускаете отрицательный контроль трансформации без добавления плазмиды, то эта чашка не должна давать никаких колоний. Колонии на чашке отрицательного контроля трансформации свидетельствуют о контаминации или необходимости приготовления свежих чашек.

– Проверьте компетентные клетки с помощью трансформации pUC19.
– Увеличьте количество высеваемого материала.

Хотя последовательное выполнение реакций BP и LR обеспечивает наивысшую эффективность с точки зрения количества колоний, наши ученые-исследователи разработали одноэтапный протокол реакции BP/LR Clonase, который позволяет проводить одновременные реакции BP и LR в одной пробирке. Мы рекомендуем использовать эту одноэтапную реакцию BP/LR Clonase для встраивания вставок среднего размера, чтобы сэкономить время. Для вставок большого размера или для Multi-Site Gateway клонирования мы рекомендуем придерживаться стандартной двухэтапной процедуры.

– Увеличьте время инкубации до 18 часов.
– Убедитесь, что реакции обработаны протеиназой K перед трансформацией.
– Проверьте, был ли использован правильный антибиотик для селекции.
– Проверьте, правильны ли последовательности сайтов att.
– Проверьте, был ли использован правильный фермент клоназы и был ли он функциональным.
– Проверьте, было ли использовано рекомендованное количество ДНК в реакции.
– Проверьте дизайн праймеров и попробуйте очистить attB-PCR продукт с помощью геля/ПЭГ.
– Если attB-PCR продукт или линейный attB экспрессионный клон слишком длинный (>5 kb), инкубируйте BP-реакцию в течение ночи.

Вы можете продолжить, но эффективность рекомбинации снизится примерно в 10 раз.

Для наиболее эффективной реакции BP лучше избегать молярного избытка сайтов attB над сайтами attP. Стандартная реакция BP (20 мкл) использует 300 нг (не более 500 нг) вектора pDONR и 30-300 нг ПЦР-продукта или экспрессионного клона, фланкированного attB, в течение 1 часа при 25 градусах C. Использование слишком большого количества донорского вектора в пробирке для реакции ингибирует реакцию BP, а также приводит к совместной трансформации интактного донорского вектора с Entry Clones. Это уменьшит количество колоний на чашке, убивая трансформированные E. coli из-за наличия гена ccdB. Более длительное время инкубации, до 24 часов, можно использовать для преобразования большего процента исходной attB-ДНК в продукт. Для ПЦР-продуктов > 4 т.п.н. количество полученных колоний на фмоль добавленной ПЦР-ДНК уменьшается с увеличением размера. Таким образом, для больших ПЦР-продуктов рекомендуется увеличить количество ДНК как минимум до 100 фмоль ПЦР-продукта на 20 мкл реакции и использовать инкубации продолжительностью более одного часа (например, 6 часов или в течение ночи до 24 часов). Самая большая ПЦР-амплифицированная ДНК, клонированная внутри компании, составляла 10,1 т.п.н. Увеличение инкубации до 4-6 часов обычно увеличивает выход колоний в 2-3 раза, а 16-24 часа обычно увеличивают выход колоний в 5-10 раз.

Основы векторов pDONR221 и pDONR/Zeo совершенно идентичны, за исключением маркера устойчивости к антибиотикам. pDONR221 обладает маркером устойчивости к антибиотику канамицину, в то время как pDONR/Zeo обладает маркером устойчивости к зеоцину.

pDONR201 и pDONR207 можно использовать, но они реплицируются менее эффективно, чем донорные векторы, которые мы предлагаем, pDONR221 и pDONR/Zeo, даже несмотря на то, что pDONR201 и pDONR207 содержат pUC ori. Это приводит к снижению выхода плазмиды. С pDONR221 выход плазмиды составляет от 0,5 до 1,0 мкг ДНК на мл культуры.

Наименьшая вставка, успешно клонированная в вектор pDONR в нашей лаборатории, составляет 70 п.н., а наибольшая — 12 т.п.н. Хотя успешное клонирование небольших вставок размером 50-200 п.н. зависит от последовательности, литературные данные показывают, что очень маленькие вставки (~30 п.н.) не будут клонироваться эффективно (Cheo et al., Genome Research, 14:2111-2120). Для вставок размером более 70 п.н. эффективность клонирования снижается с увеличением размера вставки. Для вставок размером более 5 т.п.н. мы рекомендуем инкубировать BP-реакцию клонирования в течение ночи.

Теоретически нет ограничений на размер вставки для BP-реакции с вектором pDONR. Максимальный размер, протестированный нами, составляет 12 kb. TOPO-векторы более чувствительны к размеру вставки, и 3-5 kb является верхним пределом для приемлемой эффективности клонирования.

Пожалуйста, ознакомьтесь со страницей 13 руководства “Gateway Technology withClonase II” для получения информации.

После получения вашего attB-ПЦР продукта мы рекомендуем его очистить, чтобы удалить ПЦР-буфер, невключенные dNTP, attB праймеры и любые attB праймер-димеры. Праймеры и праймер-димеры могут эффективно рекомбинировать с вектором-донором в BP реакции и могут увеличить фон после трансформации в E. coli, в то время как оставшийся ПЦР-буфер может ингибировать BP реакцию. Стандартные протоколы очистки ПЦР-продукта с использованием экстракции фенолом/хлороформом с последующим осаждением ацетатом аммония и этанолом или изопропанолом не рекомендуются для очистки attB-ПЦР продукта, поскольку эти протоколы обычно имеют пределы исключения менее 100 п.н. и неэффективно удаляют крупные праймер-димерные продукты. Мы рекомендуем протокол очистки с использованием ПЭГ (см. страницу 17 руководства Gateway Technology with Clonase II). Если вы используете вышеуказанный протокол, а ваш attB-ПЦР продукт по-прежнему недостаточно очищен, вы можете дополнительно очистить продукт с помощью гель-электрофореза. Мы рекомендуем использовать набор PureLink Quick Gel Extraction kit.

Проверьте генотип используемого вами клеточного штамма. Наши векторы назначения Gateway обычно содержат кассету ccdB, которая, если она не нарушена, будет ингибировать рост E. coli. Поэтому неклонированные векторы следует размножать в клеточном штамме, обеспечивающем выживание ccdB, таком как наши компетентные клетки ccdB Survival 2 T1R.

LR Clonase II Plus содержит оптимизированную формулу рекомбинационных ферментов для использования в MultiSite Gateway LR реакциях. LR Clonase и LR Clonase II не рекомендуются для MultiSite Gateway LR рекомбинационных реакций, но LR Clonase II Plus совместим как с многосайтовыми, так и с односайтовыми LR рекомбинационными реакциями.

Когда LR-реакция завершена, реакция останавливается с помощью протеиназы K и трансформируется в *E. coli*, что приводит к получению экспрессионного клона, содержащего интересующий ген. Типичная LR-реакция с последующей обработкой протеиназой K дает примерно от 35 000 до 150 000 колоний на 20 мкл реакции. Без обработки протеиназой K можно наблюдать снижение количества колоний до 10 раз. Несмотря на это снижение, часто все еще достаточно колоний, содержащих интересующий ген, чтобы продолжить эксперимент, поэтому при необходимости этап с протеиназой K можно опустить после завершения LR-реакции.

В большинстве случаев ДНК вектора pENTR будет недостаточно для прямого перехода от TOPO клонирования к LR реакции. Для эффективной LR реакции требуется от 100 до 300 нг вектора pENTR, и для получения такого количества ДНК необходим минипреп колонии после TOPO трансформации. Однако, если вы хотите попробовать, вот несколько рекомендаций для попытки прямого перехода к LR реакциям из TOPO реакции с использованием векторов pENTR/D, SD TOPO или pCR8/GW/TOPO:

1. Инактивируйте топоизомеразу нагреванием после реакции TOPO клонирования, инкубируя реакцию при 85 градусах C в течение 15 минут.
2. Используйте всю реакцию (6 мкл) в реакции LR Clonase. Никакие этапы очистки не требуются.
3. Разделите завершенную LR реакцию на 4 пробирки и проведите трансформации с каждой пробиркой. Вы не можете трансформировать всю реакцию объемом 20 мкл в одной трансформации, и мы не пробовали осаждение этанолом, а затем одиночную трансформацию.

При попытке использования этого протокола мы наблюдали очень низкую эффективность (~10 колоний/чашку). Поэтому просто имейте в виду, что, хотя это технически возможно, прямой переход к LR реакции из TOPO реакции очень неэффективен и приведет к очень низкому количеству колоний, если они вообще будут.

Чтобы получить N-концевую метку, ген интереса должен находиться в правильной рамке считывания при использовании Gateway entry векторов, не адаптированных к TOPO. Все Gateway Entry векторы, адаптированные к TOPO, автоматически помещают вставку в правильную рамку считывания, и для добавления N-концевой метки достаточно просто рекомбинировать с целевым вектором, имеющим N-концевую метку.

Чтобы присоединить C-концевую метку к интересующему гену, вставка не должна иметь стоп-кодона и должна находиться в правильной рамке считывания для совместимости с нашими целевыми векторами с C-концевой меткой. Опять же, Gateway Entry векторы, адаптированные к TOPO, автоматически помещают вставку в правильную рамку считывания. Если вы не хотите, чтобы C-концевая метка экспрессировалась, просто включите стоп-кодон в конце вставки, который находится в рамке считывания с начальным ATG.

Как правило, вам необходимо выбрать целевой вектор, прежде чем разрабатывать и клонировать свою вставку в Entry вектор. Это определит, нужно ли вам включать инициирующий ATG или стоп-кодон в вашу вставку.

Нет, не напрямую. attB-ПЦР продукт сначала необходимо клонировать, посредством BP Clonase реакции, в pDONR вектор, что создаст 'Входной Клон' с attL сайтами. Этот клон затем может быть рекомбинирован, посредством LR Clonase реакции, с Destination вектором, содержащим attR сайты. Однако, возможно выполнить обе эти реакции в один шаг, используя 'Однопробирочный Протокол', описанный в руководстве под названием 'Gateway Technology with Clonase II'.

Да, это можно сделать с помощью технологии Multisite Gateway. Технология MultiSite Gateway Pro позволяет эффективно и удобно собирать несколько фрагментов ДНК, включая интересующие гены, промоторы и IRES-последовательности, в желаемом порядке и ориентации в Gateway Expression вектор. Используя специально разработанные att-сайты для рекомбинационного клонирования, вы можете клонировать два, три или четыре фрагмента ДНК в любой Gateway Destination вектор, содержащий сайты attR1 и attR2. Полученный экспрессионный клон готов для последующей экспрессии и анализа.

Для реакции BP примерно 5-10% исходного материала превращается в продукт. Для реакции LR примерно 30% исходного материала превращается в продукт.

Основная область att-сайтов содержит последовательность узнавания для рестрикционного фермента BsrGI. Если вставленный фрагмент не содержит сайтов BsrGI, этот фермент можно использовать для вырезания полного гена из большинства Gateway-плазмид. Сайт узнавания BsrGI — 5'-TGTACA, и он присутствует в обоих att-сайтах, фланкирующих сайт вставки.

Если требуется другой сайт рестрикции, соответствующую последовательность следует включить в вашу вставку с помощью ПЦР.

Пределы обнаружения зависят от многих факторов, включая дизайн праймеров, размер целевого фрагмента и обилие мРНК. В наших руках эта система смогла обнаружить мРНК GAPDH из всего лишь 1,0 пг общей РНК HeLa при использовании в сочетании с Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity.

У нас есть альтернативный метод под названием «Протокол attB адаптерной ПЦР», в котором вы создаете свой ген-специфический праймер только с 12 дополнительными основаниями attB и используете универсальные адаптерные праймеры attB. Этот протокол позволяет использовать более короткие праймеры для амплификации attB-ПЦР продуктов, используя четыре праймера вместо обычных двух в ПЦР-реакции. Вы можете найти последовательность этих праймеров в протоколе на странице 45 руководства «Технология Gateway с Clonase II».

Существует протокол, в котором все 4 праймера, упомянутые выше, находятся в одной ПЦР-реакции. Вы можете найти этот протокол в следующей статье: Quest vol. 1, Issue 2, 2004. Лучшее соотношение первого ген-специфического и второго attB праймеров было 1:10.

ДНК-полимераза Platinum Taq предварительно связана со смесью антител, которые ингибируют активность полимеразы до этапа начальной денатурации в ПЦР. В результате устраняется неспецифическая активность полимеразы при более низких температурах во время подготовки и обратной транскрипции, что обеспечивает больший выход и специфичность целевого продукта.

Одношаговая система ОТ-ПЦР SuperScript III с ДНК-полимеразой Platinum Taq рекомендуется для амплификации РНК-мишеней размером до 4,5 т.п.н., а одношаговая система ОТ-ПЦР SuperScript II с ДНК-полимеразой Platinum Taq рекомендуется для амплификации РНК-мишеней размером до 3,5 т.п.н. Несмотря на то, что одношаговые системы ОТ-ПЦР SuperScript II и III с Platinum Taq High Fidelity могут амплифицировать более мелкие мишени, они рекомендуются для амплификации РНК-мишеней размером от 1 т.п.н. до 9 т.п.н.

Мы не предлагаем готовые праймеры, но можем рекомендовать следующие последовательности, которые можно заказать в качестве пользовательских праймеров для секвенирования pDONR201:
Прямой праймер, проксимальный к attL1: 5'- TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC
Обратный праймер, проксимальный к attL2: 5'-GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC

1. Изучение белок-белковых взаимодействий методом дрожжевого двухгибридного анализа Walhout AJ, Sordella R, Lu X, Hartley JL, Temple GF, Brasch MA, Thierry-Mieg N, Vidal M.

2. Картирование белковых взаимодействий в C. elegans с использованием белков, участвующих в развитии вульвы. Science Jan 7th 2000; 287(5450), 116-122 Davy, A. et al.

3. Карта белок-белковых взаимодействий 26S протеасомы Caenorhabditis elegans. EMBO Reports (2001) 2 (9), p. 821-828. Walhout, A.J.M. and Vidal, M. (2001).

4. Высокопроизводительные дрожжевые двухгибридные анализы для крупномасштабного картирования белковых взаимодействий. Methods: A Companion to Methods in Enzymology 24(3), pp.297-306

5. Крупномасштабный анализ белковых комплексов Gavin, AC et al. Функциональная организация протеома дрожжей посредством систематического анализа белковых комплексов. Nature Jan 10th 2002, 415, p. 141-147.

6. Систематическая субклеточная локализация белков Simpson, J.C., Wellenreuther, R., Poustka, A., Pepperkok, R. and Wiemann, S.

7. Систематическая субклеточная локализация новых белков, идентифицированных посредством крупномасштабного секвенирования кДНК. EMBO Reports (2000) 1(3), pp. 287-292.

8. Сверхэкспрессия белков и кристаллография Evdokimov, A.G., Anderson, D.E., Routzahn, K.M. & Waugh, D.S.

9. Сверхпродукция, очистка, кристаллизация и предварительный анализ рентгеновской дифракции YopM, важного фактора вирулентности, выделяемого бактерией чумы Yersinia pestis. Acta Crystallography (2000) D56, 1676-1679.

10. Evdokimov, et al. Структура N-концевого домена Yersinia pestis YopH с разрешением 2,0 Å. Acta Crystallographica D57, 793-799 (2001).

11. Lao, G. et al. Сверхэкспрессия трегалозосинтазы и накопление внутриклеточной трегалозы в клетках 293H и 293FTetR:Hyg. Cryobiology 43(2):106-113 (2001).

12. Высокопроизводительное клонирование и экспрессия Albertha J. M. Walhout, Gary F. Temple, Michael A. Brasch, James L. Hartley, Monique A. Lorson, Sander Van Den Huevel, and Marc Vidal.

13. Рекомбинационное клонирование Gateway: Применение для клонирования большого количества открытых рамок считывания или ORFeomes. Methods in Enzymology, Vol. 328, 575-592.

14. Wiemann, S. et.al., Toward a Catalog of Human Genes and Proteins: Sequencing and Analysis of 500 Novel Complete Protein Coding Human cDNAs, Genome Research (March 2001) Vol. 11, Issue 3, pp.422-435

15. Обзор в NATURE: Свободный доступ к кДНК дает импульс работе по изучению функций генов. 15 марта 2001 г., стр. 289. Создание направленных библиотек кДНК с использованием рекомбинации

16. Osamu Ohara and Gary F. Temple. Направленное конструирование библиотеки кДНК с помощью реакции рекомбинации in vitro. Nucleic Acids Research 2001, Vol. 29, no. 4. РНК-интерференция (RNAi)

17. Varsha Wesley, S. et al. Конструирование для эффективного, результативного и высокопроизводительного сайленсинга генов в растениях. The Plant Journal 27(6), 581-590 (2001). Создание ретровирусных конструкций

18. Loftus S K et al. Создание векторов RCAS, полезных для функционального геномного анализа. DNA Res 31;8(5):221 (2001).

19. James L. Hartley, Gary F. Temple and Michael A. Brasch. Клонирование ДНК с использованием сайт-специфической рекомбинации in vitro. Genome Research (2000) 10(11), pp. 1788-1795.

20. Reboul et al. Последовательности меток открытых рамок считывания (OST) подтверждают существование по меньшей мере 17 300 генов у C. elegans. Nature Genetics 27(3):332-226 (2001).

21. Kneidinger, B. et al. Идентификация двух GDP-6-деокси-D-ликсо-4-гексулозоредуктаз, синтезирующих GDP-D-рамнозу в Aneurinibacillus thermoaerophilus L420-91T*. JBC 276(8) (2001).

Последовательность attP1 (pDONR) выглядит так:
AATAATGATT TTATTTTGAC TGATAGTGAC CTGTTCGTTG CAACAAATTG ATGAGCAATGCTTTTTTAT AATGCCAACT TTGTACAAAA AAGC[TGAACG AGAAACGTAA AATGATATAA ATATCAATAT ATTAAATTAG ATTTTGCATA AAAAACAGACTA CATAATACTG TAAAACACAA CATATCCAGT CACTATGAAT CAACTACTTA GATGGTATTA GTGACCTGTA]

Область в скобках — это место, где сайт «разрезается» и заменяется последовательностью attB1-фрагмента для создания сайта attL1. Последовательность GTACAAA является последовательностью перекрытия, присутствующей во всех сайтах att1, и всегда «разрезается» непосредственно перед первым G.

Последовательность перекрытия в сайтах attP2 — CTTGTAC, разрез перед C. Вот attP2:
ACAGGTCACT AATACCATCT AAGTAGTTGA TTCATAGTGA CTGGATATGT TGTGTTTTAC AGTATTATGT AGTCTGTTTT TTATGCAAAA TCTAATTTAA TATATTGATA TTTATATCAT TTTACGTTTC TCGTTCAGCT TTCTTGTACA AAGTTGGCAT TATAAGAAAG CATTGCTTAT AATTTGTTG CAACGAACAG GTCACTATCA GTCAAAATAA AATCATTATT

Итак, attL1 (Входной клон) должен выглядеть так:
A ATAATGATTT TATTTTGACT GATAGTGACC TGTTCGTTGC AACAAATTGA TGAGCAATGC TTTTTTATAA TGCCAACT TT G TAC AAA AAA GC[A GGC T]NN NNN

attL2 (Входной клон) должен выглядеть так:
NNN N[AC C]CA GCT TT CTTGTACA AAGTTGGCAT TATAAGAAAG CATTGCTTAT CAATTTGTTG CAACGAACAG GTCACTATCA GTCAAAATAA AATCATTATT

Последовательность в скобках происходит из attB, а N — это ваша ген-специфическая последовательность.

Примечание: При создании входного клона с помощью BP-реакции и ПЦР-продукта векторный остов не совпадает с остовом векторов Gateway Entry. Остовом в случае ПЦР BP клонирования является pDONR201.

Все следующие липиды стабильны при 4º C в течение как минимум одного года:
11668-019 Lipofectamine 2000
10362-100 Cellfectin II
10459-014 DMRIE-C
10964-013 Lipofectamine PLUS
18292-011 Lipofectin
18324-012 Lipofectamine

Для ПЦР-фрагментов нет ограничений по размеру, если они клонируются в вектор pDONR. Верхний предел для эффективного клонирования в TOPO-адаптированный входной вектор Gateway составляет примерно 5 т.п.н. Реакция рекомбинации Gateway может происходить между фрагментами ДНК размером до 150 т.п.н.

Дестинационные векторы, содержащие N-концевые партнерские белки, будут экспрессировать белки, содержащие аминокислоты, полученные из сайта attB1, который состоит из 25 оснований. Это означает, что в дополнение к любому тегу (6x His и/или эпитопному тегу антитела), N-конец экспрессируемого белка будет содержать дополнительные 9 аминокислот из последовательности attB1 - типичная аминокислотная последовательность - Thr-Ser-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ala-Gly-nnn, где nnn будет зависеть от кодонной последовательности вставки.

Влияние на функцию белка: Исследователь (Simpson et al. EMBO Reports 11(31):287-292, 2000) продемонстрировал, что GFP-слияния (N-концевые и C-концевые) локализовались в правильном внутриклеточном компартменте. Экспрессионные конструкции были созданы с использованием Gateway клонирования, поэтому рекомбинантный белок содержал аминокислотную последовательность attB1 или attB2. Локализационная функция клонированных рекомбинантных белков была сохранена.

Влияние на экспрессию: Мы не наблюдали влияния сайтов attB на уровни экспрессии в клетках E. coli, насекомых и млекопитающих. Ген gus был клонирован в бактериальные экспрессионные векторы (для экспрессии нативного и N-концевого слитого белка) с использованием стандартных методов клонирования и экспрессирован в бактериях. Gus также был клонирован в дестинационные векторы Gateway (для экспрессии нативного и N-концевого слияния) и экспрессирован. При сравнении экспрессии белка не было разницы в количестве производимого белка. Это демонстрирует, что в этом конкретном случае сайты attB не мешают транскрипции или трансляции.

Влияние на растворимость: Исследователь из NCI показал, что слияния с мальтозосвязывающим белком, сконструированные с помощью Gateway Cloning, были растворимы. Экспрессированные слитые белки содержали аминокислотную последовательность attB между мальтозосвязывающим белком и клонированным белком. Возможно, что некоторые белки, содержащие последовательность attB, могут оставаться нерастворимыми при экспрессии в E.coli.

Влияние на сворачивание: Two Hybrids скрининги показывают одни и те же взаимодействующие белки, идентифицированные с и без последовательности attB. Предположительно, для протеин-протеиновых взаимодействий требуется правильное сворачивание белка. Возможно, что некоторые белки, содержащие последовательность attB, могут сворачиваться неправильно.

Поскольку последовательности attB находятся на 5'-конце олигонуклеотидов, они не будут отжигаться к целевой матрице в первом раунде ПЦР. Иногда продукт ПЦР становится более специфичным с праймерами attB, вероятно, из-за более длинной последовательности отжига (вся attB плюс ген-специфическая последовательность) после первого раунда амплификации. Как правило, нет необходимости изменять условия ПЦР, когда праймеры имеют дополнительную последовательность attB

Нет, это не совсем реально из-за того, что последовательность attL составляет примерно 100 п.н., что слишком много для эффективного синтеза олигонуклеотидов. Наша максимальная длина последовательности для заказа пользовательских праймеров составляет 100 нуклеотидов. В отличие от этого, последовательности attB имеют длину всего 25 п.н., что является вполне разумной длиной для добавления на 5'-конец ген-специфичных ПЦР-праймеров.

Информацию о векторах можно найти в руководствах к продуктам или непосредственно на нашем веб-сайте, введя каталожный номер продукта в поле поиска. Карта вектора, схема сайта клонирования и информация о последовательности будут привязаны к странице продукта.

Номенклатура Gateway соответствует номенклатуре lambda, но мы используем числа для различения модифицированных версий сайтов att (attB1, attB2, attP1, attP2 и так далее). Мы ввели мутации в сайты att, чтобы обеспечить специфичность и направленность реакции рекомбинации. Например, attB1 будет рекомбинировать только с attP1, а не с attP2.

Первый шаг — создание клона Entry для вашего интересующего гена. У нас есть 3 варианта: Первый — реакция BP рекомбинации с использованием системы ПЦР-клонирования с технологией Gateway. Это рекомендуется для клонирования больших (>5 т.п.н.) ПЦР-продуктов. У нас также есть Gateway-совместимые TOPO-векторы клонирования, такие как pCR8/GW/TOPO и pENTR/D-TOPO. Последний вариант — использование рестрикционных ферментов для клонирования в вектор pENTR Dual Selection.

Ген, представляющий интерес, должен быть ограничен соответствующими att-сайтами: attL (100 п.н.) во входном клоне или attB (25 п.н.) в ПЦР-продукте. Для входных клонов все, что находится между сайтами attL, будет перемещено в целевой вектор Gateway, содержащий сайты attR, а ПЦР-продукт, ограниченный сайтами attB, должен быть перемещен в донорный вектор, содержащий attP, например, pDONR221.

Расположение сайтов инициации трансляции, стоп-кодонов или fusion-меток для экспрессии должно быть учтено в вашем первоначальном плане клонирования. Например, если ваш целевой вектор содержит N-концевую метку, но не имеет C-концевой метки, вектор уже должен содержать соответствующий сайт начала трансляции, но стоп-кодон должен быть включен в вашу вставку.

Да, увеличение времени инкубации с 1 часа до 4 часов обычно увеличивает количество колоний в 2-3 раза. Инкубация в течение ночи при комнатной температуре обычно увеличивает выход колоний в 5-10 раз.

BP Clonase II и LR Clonase II можно замораживать/размораживать как минимум 10 раз без значительной потери активности. Однако, вы все равно можете разделить ферменты на аликвоты, чтобы свести к минимуму вариабельность, связанную с замораживанием/размораживанием.

Эти ферменты более стабильны, чем оригинальные BP и LR Clonase, и могут храниться при -20 градусах C в течение 6 месяцев.

Мини-препараты ДНК (щелочной лизис) хорошо работают в реакциях Gateway клонирования. Важно, чтобы процедура удаляла загрязняющую РНК для точного количественного определения. Рекомендуется использовать плазмидную ДНК, очищенную с помощью наших наборов для очистки нуклеиновых кислот S.N.A.P., наборов ChargeSwitch или наборов PureLink.

Простой способ экспрессировать белок с лидерной последовательностью - закодировать лидерную последовательность в целевом векторе. Другой вариант - субклонировать лидерную последовательность в вектор вставки с использованием рестрикционных ферментов или включить лидерную последовательность в прямой ПЦР-праймер при клонировании ПЦР-продукта в вектор вставки. Пожалуйста, ознакомьтесь с Esposito et al. (2005), Prot. Exp. & Purif. 40, 424-428, чтобы увидеть пример того, как частичная лидерная последовательность для секреции была включена в вектор вставки.

Это зависит от того, экспрессируете ли вы слитый или нативный белок в Gateway векторе назначения. Для N-концевого слитого белка ATG будет определяться вектором назначения и будет находиться выше сайта attB1. Для C-концевого слитого белка или нативного белка ATG должен быть предоставлен вашим интересующим геном и будет находиться ниже сайта attB1.

Сайты Gateway attB происходят от сайт-специфической рекомбинации бактериофага лямбда, но модифицированы для удаления стоп-кодонов и уменьшения вторичной структуры. Основные регионы также были модифицированы для специфичности (т.е. attB1 будет рекомбинировать с attP1, но не с attP2).

Эксперименты по экспрессии показали, что дополнительные аминокислоты, вносимые сайтом attB в слитый белок, скорее всего, не влияют на уровни экспрессии или стабильность белка. Кроме того, они, по-видимому, не оказывают никакого влияния на двухгибридные взаимодействия в дрожжах. Однако, как и в случае добавления любых дополнительных последовательностей, возникающих в результате использования меток, возможные эффекты будут зависеть от белка.

Нет, attB праймеры обладают высокой специфичностью при стандартных условиях ПЦР. Мы проводили амплификацию из РНК (ОТ-ПЦР), библиотек кДНК, геномной ДНК и плазмидных матриц без каких-либо проблем со специфичностью.

Нет. Эти группы эффективно блокируют N-конец.

Самый маленький размер, который мы рекомбинировали, — это фрагмент ДНК длиной 70 п.н., расположенный между att-сайтами. Очень маленькие фрагменты трудно клонировать, поскольку они негативно влияют на топологию реакции рекомбинации.

Теоретически ограничений по размеру нет. Продукты ПЦР длиной от 100 п.н. до 11 т.п.н. легко клонировались в Gateway-вектор pDONR. Другие фрагменты ДНК размером до 150 т.п.н. с att-сайтами успешно рекомбинируют с Gateway-совместимым вектором. Для вставок большого размера рекомендуется инкубация в течение ночи.

Обычно достаточно стандартной обессоленной чистоты для создания attB праймеров. Мы исследовали олигонуклеотиды, очищенные с помощью ВЭЖХ, для Gateway клонирования (около 50 пар оснований) и обнаружили лишь примерно 2-кратное увеличение числа колоний по сравнению со стандартными обессоленными праймерами. Если получено слишком мало колоний, вы можете попробовать увеличить количество используемого ПЦР-продукта и/или инкубировать BP-реакцию в течение ночи.

Технология клонирования Gateway — это простая в использовании система для клонирования и субклонирования сегментов ДНК (например, целевых генов), облегчающая функциональный анализ генов, экспрессию белков и интеграцию технологических платформ. Можно также легко клонировать ПЦР-продукты в так называемые 'Entry' векторы Gateway. Для перемещения вставок из одного вектора в другой, технология клонирования Gateway использует сайт-специфическую рекомбинацию на основе бактериофага лямбда. Нет необходимости использовать рестрикционные ферменты и лигазу для субклонирования вставок.

Одним из преимуществ технологии клонирования Gateway является то, что гены, представленные в одном векторе Gateway Entry, могут быть субклонированы во множество различных векторов Gateway Destination. После этой часовой реакции субклонирования in vitro высокий процент полученных колоний несет желаемый экспрессионный клон. Для получения более подробной информации, пожалуйста, обратитесь к руководству по продукту для cat# 12535029 или cat# 12535037.