Click-iT™ EdU Alexa Fluor™ 488 Набор для проточной цитометрии, 50 анализов

Образец можно хранить после фиксации в PBS при 4^oC в течение ночи. Для более длительного хранения (до 1 недели) храните в буфере с 1-2% формальдегида или в формалине для ограничения роста микроорганизмов. Если вы используете азид натрия в качестве ингибитора микроорганизмов, его необходимо полностью удалить перед реакцией Click-iT.

Мы не рекомендуем использовать конъюгаты фаллоидина для окрашивания актина в сочетании с традиционными реакциями Click-iT или Click-iT Plus, поскольку фаллоидин чрезвычайно чувствителен к присутствию меди.

Для окрашивания актина в сочетании с традиционными реакциями Click-iT или Click-iT Plus мы рекомендуем использовать анти-α-актиновые антитела для окрашивания актина в цитоскелете.

Другой вариант - использовать наборы Click-iT Plus Alexa Fluor Picolyl Azide Toolkit (Кат. Номера C10641, C10642, C10643). В этих наборах Click-iT Plus медь и протектор меди поставляются отдельно, что упрощает титрование концентрации меди для получения оптимальной маркировки с минимальным повреждением, опосредованным медью. Возможно, потребуется оптимизировать реакцию клик-связывания с минимально возможной концентрацией меди, а затем выполнить окрашивание фаллоидином.

Да, но отдельные продукты поставляются не в том же количестве, что и в наборах Click-iT EdU; количество азида красителя, предоставляемого в наборах Click-iT, является конфиденциальной информацией. См. следующие номера каталогов для отдельных продуктов:
- Кат. № A10266: Азид Alexa Fluor 488
- Кат. № A10270: Азид Alexa Fluor 594
- Кат. № A10277: Азид Alexa Fluor 647

Реакция клик-химии эффективна только тогда, когда медь находится в нужной валентности. Азиды и алкины не будут реагировать друг с другом без меди. Убедитесь, что смесь для реакции клик-химии используется сразу после приготовления, когда концентрация меди (II) максимальна.
Не используйте аддитивный буфер, который пожелтел; он должен быть бесцветным, чтобы быть активным.
Клетки должны быть адекватно фиксированы и пермеабилизированы, чтобы фермент TdT и реагенты для клик-химии имели доступ к ядру. Образцы тканей требуют обработки протеиназой K или другими протеолитическими ферментами для достаточного доступа TdT.
Некоторые реагенты могут связывать медь и снижать ее эффективную концентрацию, доступную для катализа реакции клик-химии. Не включайте никакие хелаторы металлов (например, ЭДТА, ЭГТА, цитрат и т. д.) ни в один буфер или реагент до реакции клик-химии. Избегайте буферов или реагентов, которые содержат другие ионы металлов, которые могут быть окислены или восстановлены. Может быть полезно включить дополнительные этапы промывки клеточного или тканевого образца перед выполнением реакции клик-химии.
Вы можете повторить реакцию клик-химии со свежими реагентами, чтобы попытаться улучшить сигнал. Увеличение времени реакции клик-химии более 30 минут не улучшит слабый сигнал. Выполнение второй 30-минутной инкубации со свежими реагентами для реакции клик-химии более эффективно для улучшения мечения.
Ваши клетки могут быть не апоптотическими. Подготовьте положительный контроль, обработанный ДНКазой I, чтобы убедиться, что ферментативная реакция TdT и реакция мечения клик-химии работают правильно.

Реакция клик-химии очень селективна между азидом и алкином. Никаких других побочных реакций в биологической системе не возможно. Любой неспецифический фон обусловлен нековалентным связыванием красителя с различными клеточными компонентами. Select FX Signal Enhancer не эффективен для уменьшения неспецифического, основанного на заряде связывания красителей после реакции клик-химии; мы не рекомендуем его использование с реагентами Click-iT. Лучший способ уменьшить фон - увеличить количество промывок BSA. Вам всегда следует проводить контроль без красителя или без клик-реакции в тех же условиях обработки и детекции, чтобы убедиться, что фон действительно обусловлен красителем, а не аутофлуоресценцией. Вам также следует провести полную реакцию клик-химии на контрольном образце без фермента TdT, чтобы проверить специфичность сигнала реакции клик-химии.

Медь в реакции клик-химии в небольшой степени денатурирует ДНК (хотя и не настолько сильно, как требуется для эффективного обнаружения BrdU), что может повлиять на аффинность связывания ДНК-красителей, включая DAPI и Hoechst. Этот эффект должен быть заметен только с классическими наборами EdU, а не с наборами Click-iT Plus EdU, в которых используется более низкая концентрация меди.

Реакция клика эффективна только тогда, когда медь находится в подходящей валентности. За исключением реакции DIBO алкин-азид, азиды и алкины не будут реагировать друг с другом без меди. Убедитесь, что реакционная смесь для клика используется немедленно после приготовления, когда концентрация меди (II) находится на самом высоком уровне.
Не используйте буферную добавку, которая пожелтела; она должна быть бесцветной, чтобы быть активной.
Клетки должны быть адекватно зафиксированы и проницаемы, чтобы реагенты для клика имели доступ к внутриклеточным компонентам, которые включили субстрат(ы) для клика.
Некоторые реагенты могут связывать медь и снижать ее эффективную концентрацию, доступную для катализа реакции клика. Не включайте никакие хелаторы металлов (например, ЭДТА, ЭГТА, цитрат и т. д.) ни в один буфер или реагент до реакции клика. Избегайте буферов или реагентов, которые содержат другие ионы металлов, которые могут окисляться или восстанавливаться. Может помочь включение дополнительных этапов промывки образца клетки или ткани перед проведением реакции клика.
Вы можете повторить реакцию клика со свежими реагентами, чтобы попытаться усилить сигнал. Увеличение времени реакции клика более 30 минут не улучшит слабый сигнал. Проведение второй 30-минутной инкубации со свежими реагентами для клика более эффективно для улучшения мечения.
Слабый сигнал также может быть связан с низким включением EdU, EU или других субстратов для клика. Другие субстраты для клика (например, AHA, HPG, пальмитиновая кислота, азид и т. д.), включенные в клеточные компоненты, могли быть потеряны, если они не были адекватно сшиты на месте или если был использован неправильный фиксатор. Для субстратов для клика, которые включаются в мембрану или липиды, следует избегать использования спиртовых или ацетоновых фиксаторов и проницаемых агентов.
Включенный субстрат для клика должен быть доступен во время реакции клика; мечение включенных аналогов аминокислот может быть ниже в нативных белках по сравнению с денатурированными белками.
Возможно, вам потребуется оптимизировать условия метаболического мечения, включая время или концентрацию инкубации аналога. Клетки, которые здоровы, не имеют слишком высокого номера пассажа и не слишком переполнены, могут лучше включать аналог. Вы можете создать положительный контроль, включив дополнительные дозы субстрата для клика в несколько моментов времени в течение времени инкубации, которое охватывает или близко охватывает время удвоения интересующего типа клеток.

Реакция 'клик' очень селективна между азидом и алкином. Никаких других побочных реакций в биологической системе не происходит. Любой неспецифический фоновый сигнал обусловлен нековалентным связыванием красителя с различными клеточными компонентами. Лучший способ уменьшить фон - увеличить количество промывок БСА. Всегда проводите контрольную реакцию без красителя или без реакции 'клик' в тех же условиях обработки и детекции, чтобы убедиться, что фон действительно вызван красителем, а не аутофлуоресценцией. Вы также можете выполнить полную реакцию 'клик' только с растворителем-носителем, без EdU или EU контроля, чтобы проверить специфичность сигнала реакции 'клик'.

Нет, реагент для метаболической метки EdU необходимо использовать на живых клетках, но фактическая реакция детекции должна проводиться на фиксированных и пермеабилизированных образцах, так как азидные реагенты для детекции и компоненты буфера не проникают в клетки.

Это возможно, но если вы не полностью пометите весь метаболически включенный EdU в первой реакции щелчка, то он будет помечен во второй реакции щелчка для мечения TUNEL, что приведет к ложноположительным результатам для апоптотических клеток. Было бы проще совместить мечение Click-iT EdU с мечением BrdU TUNEL, так как обнаружение BrdU не будет перекрестно реагировать с клетками, помеченными EdU. Если вы действительно хотите выполнить двойное мечение EdU для обнаружения как пролиферации, так и апоптоза, то вам следует повторить реакцию щелчка для обнаружения метаболически включенного EdU, используя свежие реагенты для щелчка, чтобы убедиться, что весь включенный EdU помечен до выполнения анализа EdU TUNEL. Затем вам следует выполнить контрольный анализ EdU TUNEL без фермента TdT, чтобы проверить, что нет сигнала, генерируемого реакцией щелчка TUNEL.

Да, маркировку EdU и BrdU можно объединить для двухступенчатой маркировки пролиферации клеток в культивируемых клетках и *in vivo*. BrdU будет преимущественно включаться в ДНК, поэтому сначала выполните инкубацию с EdU, а затем инкубацию с BrdU. Удаление EdU из среды не требуется в культивируемых клетках, когда BrdU добавляется в качестве второй метки. Выполните фиксацию спиртом, а затем какой-либо метод денатурации ДНК, как требуется для протокола обнаружения BrdU, а затем выполните реакцию клик-мечения для обнаружения EdU, а затем маркировку антителами для обнаружения BrdU. Обязательно выберите антитело к BrdU, которое не имеет перекрестной реактивности с EdU, например, наш клон MoBU-1 (Кат. № B35141). Многие антитела к BrdU показали некоторую степень перекрестной реактивности с включенным EdU. Вот ссылка на пример протокола двухступенчатой маркировки с использованием EdU и BrdU.

Мы не проводили валидацию использования EdU для оценки пролиферации в 3D-культурах, но, поскольку этот реагент совместим с маркировкой клеток *in vivo*, ожидается, что он также будет маркировать клетки в 3D-культурах. В литературе есть ряд публикаций, в которых этот продукт используется в 3D-культурах; вот некоторые цитаты:

Lei Y, Schaffer DV (2013) A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A 110:E5039-E5048.
Derda R, Laromaine A, Mammoto A et al. (2009) Paper-supported 3D cell culture for tissue-based bioassays. Proc Natl Acad Sci U S A 106:18457-18462.
Robertson FM, Ogasawara MA, Ye Z et al. (2010) Imaging and Analysis of 3D Tumor Spheroids Enriched for a Cancer Stem Cell Phenotype. J Biomol Screen 15:820-829.

Да, вы можете хранить образцы после фиксации в формальдегиде и промывки, перед этапом пермеабилизации. Просто храните клетки в PBS, хорошо закройте и запечатайте контейнер и храните при 4 градусах C. Клетки будут в порядке в течение как минимум недели. Вы также можете хранить образцы после реакции клика и этапов промывки, а затем выполнить любое иммуноокрашивание и контрастирование ядер на следующий день.

Нет, реагент для детекции и реагенты, необходимые для проведения клик-реакции, нельзя смешивать между наборами Click-iT Plus и оригинальными наборами Click-iT. В анализе Click-iT Plus используется модифицированный пиколил-азидный краситель и пониженная концентрация меди в сочетании со специальным защитным средством для меди, которое локализует медь в месте клик-реакции, в то время как в оригинальных наборах Click-iT используется немодифицированный азидный краситель и более высокие концентрации меди для проведения клик-реакции.

В наборе Click-iT Plus используется модифицированный пиколил-азидный краситель и сниженная концентрация меди в сочетании со специальным защитным средством для меди, которое локализует медь в месте включенной алкиновой группы и, таким образом, минимизирует повреждение биомолекул медью. В оригинальных наборах Click-iT используются немодифицированный азидный краситель и более высокие концентрации меди для проведения клик-реакции, что может инактивировать ферменты, включая HRP, и подавлять флуоресценцию GFP, RFP, mCherry и других флуоресцентных белков, а также R-фикоэритрина. Если вы не хотите изменять протокол окрашивания антителами или у вас есть клетки, экспрессирующие флуоресцентные белки, используйте наборы Click-iT Plus.